高中生物專項練習：基因工程的原理和技術

第6課時基因工程的原理和技術

【課標要求】1.概述基因工程是在遺傳學、微生物學、生物化學和分子生物學等學科基礎上發

展而來的。2.闡明DNA重組技術的實現需要利用限制性內切核酸酶、DNA連接酶和載體三

種基本工具。3.闡明基因工程的基本操作程序主要包括獲取目的基因、構建重:組DNA分子、

將重組DNA分子導入受體細胞和檢測目的基因及其表達產物等步驟。4.概述人們根據基因工

程原理，進行蛋白質設計和改造，可以獲得性狀和功能更符合人類需求的蛋白質。5.舉例說

明依據人類需要對原有蛋白質結構進行基因改造、生產目標蛋白的過程。6.活動：DNA的

粗提取和鑒定。7.PCR擴塢DNA片段及凝膠電泳鑒定。

考點一基因工程的工具

■梳理歸納夯實必備知識

1.基因工程的建立

基因工程是指有意識地把一個人們

基因工程所需要的基因轉入另一個生物體中,

的定義使后者獲得新的遺傳性狀或衣達所

需要產物的技術

多個實驗證明DNA是遺傳物質

“中心法則”闡明了遺傳信息的傳遞

和表達機制

遺傳密碼的破譯,為基因在不同福

發展歷程物細胞內進行表達的設想奠定了理

論基礎

工具酶、載體的發現實現了對DNA

分子的剪切、連接和復制

轉基因技術得以實現

2.限制酶、DNA連接酶與載體

、識別特定的核甘酸序列并催

制

限市葉化特定部位的兩個核件酸之

切

內-----間的磷酸：酯鍵水解

酸

(酶

留生）-產生黏性東端或平木端

基

因

工「麻向_將2個DNA分子的雙鏈通過

叱曳廠磷酸二酯鍵分別連接起來

程DNA

的連接酶cE.coliDNA連接酶：連接黏性

基

本I也為T4DNA連接施：既能連接黏性

工I末端也能連接平末端

具

)［種類）-質粒、噬曲體、動值物病盛等

能自主復制；有一種或多種

需具備

一限制制的識別序列；有?篩選

的條件作用的標記基因

【歸納總結】比較DNA連接酶和DNA聚合酶

種類DNA聚合酶DNA連接酶

催化單個脫氧核甘酸加到已

催化兩個DNA片段之間形成磷酸二

作用實質有脫氧核甘酸片段上，形成磷

酣鍵

酸二酯鍵

不同點催化形成與模板鏈互補的催化具有互補黏性末端或平末端的

作用結果DNA鏈，形成新的雙鏈DNADNA片段連接起來，形成重組DNA

分子分子

模板需要不需要

相同點①化學本質都是蛋白質；②W中是催化形成磷酸二酯鍵

【提醒】（1）限制酶的選擇方法

PstISniaIPstI

Ii,i

Sma\抗病基因EcoRl

甲

根據目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類。

①應選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選杼八丫IO

②不能選擇切點位于目的去因內部的限制酶，如圖甲不能選擇S〃0IO

③為避免目的基因和質粒的自身環化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質

粒，如圖甲也可選擇用PsfI和EcoR1兩種限制酶，但要確保質粒（如圖乙）上也有這兩種

酶的切點。

（2）標記基因的篩選原理

載體上的標記基因一般是某種抗生素的抗性基因，而受體細胞沒有抵抗該抗生素的能力。將

含有某抗生素抗性基因的載體導入受體細胞，抗性基因在受體細胞內表達，受體細胞對該抗

生素產生抗性。在含有該抗生素的培養基上，能夠生存的是被導入了載體的受體細胞(如下圖

所示)。

在含有兼節

進入受青霉素的培

體細胞I養以上培養

含有兼節青霉素只有含有栽體，并且

栽體上的抗性基因

抗性基因的我體大腸桿菌中

成功表達的大腸桿

(如質粒)有的有栽體

進入,有的沒菌才能存活并增殖

有栽體進入

3.DNA的粗提取與鑒定

(1)實驗原理

(3)DNA與蛋白質在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同

項目溶解規律2mol/LNaCl溶液0.14mol/LNaCl溶液

DNA溶解度

DNA溶解析出

1

C0.14

MaCl濃度(mol/L)

NaCl溶液物質的量濃度從2

蛋白質mol/L逐漸降低的過程中，蛋部分發生鹽析沉淀溶解

白質溶解度逐漸增大

■考向突破強化關鍵能力

考向一基因工程的工具

1.圖甲、乙中的箭頭表示三種限制性內切核酸酶的酶切位點，（加“表示氨葦青霉素抗性基

因，〃6戶表示新霉素抗性基因。若想將圖乙所示目的基因導入圖甲所示質粒中，下列敘述正

確的是（）

PstI，加d【n目的基因

十tII.外源DNA

t,t

BaniWIPstI

乙

A.圖甲中的質粒用〃汨I切割后，含有4個游離的璘酸基團

B.在構建重組質粒時，可用Ps/I和&"〃HI切割質粒和外源DNA

C.用R/I和”勿dHI酶切，加入DNA連接酶后可得到1種符合要求的重組質粒

D.導入目的基因的大腸桿菌可在含氨葦青霉素的培養基中生長

答案C

解析環狀質粒被限制酶切割后會出現2個游離的磷酸基團；如果用I切割外源DNA

后，會破壞目的基因；用RfI和〃山dlH切割外源DNA后，可得到兩個能與質粒連接的

DNA片段，但只有目的基因未被破壞的片段才符合要求：導入目的基因的大腸桿菌，其重組

質粒中〃〃”?已被破壞，故不可能在含氨羊青霉素的培養基中生長。

2.據圖所示，下列有關酶功能的敘述，不正確的是（）

A.限制性內切核酸睡可以切斷a處

B.DNA聚合酶可以連接a處

C.解旋酶可以使b處解開

D.DNA連接附可以連接c處

答案D

解析限制性內切核酸酶切割DNA片段的磷酸二酯鍵，A正確；DNA聚合酶將單個的脫氧

核昔酸連起來，連接的是疇酸二酯鍵，B正確；解旋酶將DNA雙鏈解開成單鏈，作用于費

鍵，C正確；DNA連接酶連接的是a處，不是c處，D錯誤。

【歸納總結】與DNA有關的四種幅

項目限制酶DNA連接辭DNA聚合酶解旋晦

作用底物DNA分子DNA分子片段脫氧核甘酸DNA分子

作用部位磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵堿基對間的氫鍵

形成黏性末端或形成重組DNA形成新的DNA形成單鏈DNA分子

作用結果

平末端分子分子

考向二DNA的粗提取與鑒定

3.（2022?湖州期中）不同儲藏條件對棉葉DNA純度及提取率（提取率越高，獲得的DNA越多）

的影響，結果如圖所示。下列有關敘述正確的是（）

2

r二

5

型

烹

<

N

C

I

(

攔

安

35()

要

)30()

>250

整2()0

型15()

V10()

N

Q50

0II.II.II.n.II.ri,

鮮葉冷鮮冷凍冷凍液氮硅膠

3d3d7d7d干燥

7d

A.利用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)處理棉葉，能使核蛋白變性并與DNA分離

B.新鮮棉葉的DNA純度最高，提取DNA的量也最多

C.冷凍保存3d組的DNA提取效果優于冷鮮保存3d

D.用二苯胺試劑鑒定，藍色最淺的是冷凍3d處理后提取的DNA

答案C

解析用十二烷基硫酸鈉(SDS)處理棉葉，能使核蛋白變性并與DNA分離，乙二胺四乙酸二

鈉(EDTA)能抑制DNA酶活性，防止核DNA被晦解，A錯誤：新鮮棉葉提取的DNA純度最

高，但提取率不高，因此新鮮棉葉提取DNA的量不是最多的，B錯誤；冷凍3d處理提取的

DNA量是最多的，因此用二苯胺試劑鑒定，藍色最深的是冷凍3d處理后提取的DNA,D

錯誤。

4.下表關于DNA粗提取與鑒定實驗的敘述，不正確的是()

選項試劑操作作用

A研磨液與生物材料混合提取溶解DNA

B2mol/LNaCl溶液與提取出的DMA混合溶解DNA

C冷卻的酒精加入到離心后的上清液中溶解DNA

D二苯胺試劑加入到溶解有DNA的Na。溶液中鑒定DNA

答案C

解析DNA不溶于酒精溶液，但是細胞中的某些蛋白質則溶于酒精，利用這一原理可以將蛋

白質和DNA進一步分離，C錯誤。

考點二基因工程的基本操作步驟

■梳理歸納夯實必備知識

1.基因的結構

位于基因的“上游”，有~RNA

聚合醐結合的位點，控制轉錄

的開始

位于基因末端,當RNA聚合

醐到達時，釋放出RNA產物.

轉錄結束

編碼蛋白質的核甘酸序列是

不連續的;編碼蛋白質的序列

稱為外顯子.外顯子間不能編

碼蛋白質的序列稱為內含了

編碼蛋白質的核甘酸序列是

連續的

2.基因工程的基本操作程序

⑴目的基因：用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因，主要是指編碼蛋白質的

基因。

(2)獲取目的基因的方法

從部分基因文庫，

從基因組文庫中通過PCR技術體

方法如cDNA文庫中化學合成法

獲取外擴增

獲取

蛋白質

目的基因的匆:基

供體細胞

的mRNA酸序列

中的DNA|逆轉錄|推測

|限制板單鏈DNA

|合成mRNA

許多DNA片段的核首變性

|插入雙鏈DNA酸序列1

過程載體|插入|推測退火

|導入載體1

|導入結構基延伸

受體菌群

受體菌群因的核

（基因組文庫）昔限序列

分離（cDNA文庫）

化學

目的基因|分崗

口的基因合成

目的基因

（3）cDNA文庫和基因組文庫的主要區別

文庫類型cDNA文庫基因組文庫

文庫大小小大

基因中啟動子和終止子無有

基因中內含子無有

基因多少某種生物的部分基因某種生物的全部基因

基因組型粵適當大小

mRNA——cDNA->與載DNA

基因獲得過程體組合一導入微生物細胞一的DNA片段f與載體組合f

克隆導入微生物細胞f克隆

-教材隱性知識

不同組織細胞和同一組織細胞在不同的發育階段，cDNA文庫是會（填"會”或“不會”）有

差異的，原因是基因的選擇性表達。

（4）通過PCR技術體外擴增目的基因

①原理：模仿體內DNA復制。

”模板：待擴增的DNA分子

原料：4種脫氧核苻三磷酸,即dNTP

②條件《

酹：hoDNA聚合酹

、引物：短的單鏈DNA

③過程

奪材L模板DNA雙鏈在高溫下(90~95七)氫鋌斷

壁廠1裂，解旋成2條單鏈______________________

退火｛溫度降低(50~60-)后物與DNA單鏈結合

-'［模板：兩條DNA單鏈,原料：4種dNTP.艇：耐

延停高溫的TaqDNA聚合酶.溫度:約72七，起點：

以引物與模板形成的小段DNA雙鏈區

④產物鑒定方法：凝膠電泳。

■教材隱性知識----------------------------------------------------------------------

①與體內DNA復制相比，PCR技術所用ThqDNA聚合酶特點是耐高溫。

②PCR擴增DNA片段大小由2個引物決定。

③在第二輪循環產物中開始出現目標DNA片段(兩條核甘酸鏈等長的DNA分子)。

3.活動：PCR擴增DNA片段及凝膠電泳鑒定

(1)實驗原理

①PCR經過多次循環變性、退火、延伸三個步驟,可獲得大量目的基因或DNA片段。

②PCR技術擴增酵母細胞中編碼核糖體RNA的DNA部分片段，長度為841bp,通過瓊脂糖

凝膠電泳進行鑒定。

③使用亞甲基藍對凝膠進行染色,再用75%酒精以及蒸餡水脫色,觀察并分析瓊脂糖凝膠中

DNA條帶。

(2)方法步驟

①PCR擴增

用微一移液器將PCR體系各成分加入0.2mL

加液-已滅菌的微一離心管中,用微坡移液器

I|反復吹吸_____________________________

c~,_」3000r/min離心30s,使反應液集中于微

四歸一離心管的底部______________________

I|將微一離心管放入PCR儀中，設置反應條

反應一件后進行PCR擴增,擴增后的PCR產物

可儲存在-20七條件下

②瓊脂糖凝膠電泳

化

熱溶

中，加

沖液

泳緩

到電

糖加

瓊脂

制備稱取

胎

出梳

心拔

結.小

全凝

膠完

；待凝

入姬

瓊后倒

糖凝

入

出.放

中取

膠盒

托從

的膠

凝膠

裝有

子,將

膠

槽

電泳

極，向

向負

端朝

孔一

,加樣

槽內

電泳

凝膠

沒過

,使其

沖液

泳緩

入電

中加

上樣緩

中加入

rker

Ma

NA

物和D

R產

向PC

加樣

樣孔內

加到加

分別

后，

均勻

.混合

沖液