枸杞中枸杞多糖含量的測定 高效液相色譜法 征求意見稿

IICSCS01.040.65

CCSB04TB

團體標準

T/NAIA×××-××××

枸杞中枸杞多糖含量的測定

高效液相色譜法

××××-××-××發布××××-××-××實施

寧夏化學分析測試協會發布

枸杞中枸杞多糖含量的測定高效液相色譜法

1范圍

本文件規定了枸杞中枸杞多糖含量的高效液相色譜測定方法。

本文件適用于枸杞子及其制品中多糖類物質：甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、

半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖含量的測定。

2規范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注

日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用本文件；不注日期的引用文件，其最新版

本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法。

3術語和定義

本文件沒有需要界定的術語和定義。

4原理

試樣中的多糖類物質先用乙醚和80%的乙醇脫脂和脫色素，再用熱水提取后用無水乙

醇沉淀多糖，醇沉多糖再用水溶解后以4moL/L三氟乙酸溶液水解為單糖，再加PMP衍生

化，溶液用微孔濾膜過濾后，用高效液相色譜法測定，內標法定量。

5試劑與材料

除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規定的一級水。

5.1甲醇、乙腈：色譜純，

5.2標準品：D-甘露糖（SLBX3678V，Sigma，CAS號3458-28-4）；D-核糖（

WXBB0660，99%，Sigma，CAS號50-69-1）；L-鼠李糖（BCBD1986V，≥99.0%，

Sigma，CAS號10030-85-0）；D-葡糖糖醛酸（SLBH6139V，≥98.0%，Sigma，CAS

號6556-12-3）；D-一水合半乳糖醛酸（BCBX5194，≥97.0%，Sigma，CAS號

91510-62-2）；D-葡萄糖（LRAB8922，Sigma，CAS號50-99-7）；D-半乳糖（

SLBM8792V，≥99.0%，Sigma，CAS號59-23-4）；D-木糖（SLBN4994V，≥99.0%

，Sigma，CAS號58-86-6）；D-阿拉伯糖（BCBV0384，≥99.0%，Sigma，CAS號

10323-20-3）；L-巖藻糖（SLBH8792V，≥99.0%，Sigma，CAS號2438-80-4）；2-

脫氧-D-核糖（20200619，含量：98.0%，國藥集團化學試劑有限公司，CAS號50-

69-1）；D-阿洛糖（C10055777，98.0%，Macklin，CAS號2595-97-3）；2-氨基-2-

脫氧-D-半乳糖鹽酸鹽（20150226，98.0%，國藥集團化學試劑有限公司，CAS號

1772-03-8）；D-果糖（100231-201305，99.4%，中檢院，CAS號57-48-7）；鹽酸氨

基葡萄糖（140649-201606，中檢院；CAS號66-84-2）

5.3內標使用溶液

精密稱取2-脫氧-D-核糖適量，用水溶解并制成每mL含1.3mg的溶液，作為內標使用

溶液。

5.4單標儲備溶液

分別準確稱取經真空干燥至恒重的甘露糖、巖藻糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、木

糖、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖適量，用水溶解并配置成質量濃度為

10mg/mL的單標儲備溶液，貯存于密閉容量瓶中避光于4℃下儲存。

5.5混合標準儲備溶液

分別精密量?。?.4）項下的單標儲備溶液適量，用水溶解并稀釋制成每mL含甘露糖

50μg、巖藻糖30μg、核糖20μg，鼠李糖70μg、葡萄糖醛酸70μg、木糖140μg、半乳糖醛

酸440μg、半乳糖400μg、阿拉伯糖330μg、葡萄糖500μg的溶液，作為線性測定混合標準

儲備溶液。

6儀器與設備

6.1高效液相色譜儀（配紫外檢測器）。

6.2分析天平

6.3旋轉蒸發儀。

6.4離心機。

6.5超純水機。

7供試品溶液的制備

取-18℃冷凍冰箱中保存的枸杞子樣品，粉碎，-18℃冷凍備用。準確稱取枸杞細粉2g

（精確至0.01mg）至錐形瓶中，加乙醚200mL，加熱回流2h，靜置，放冷，小心棄去乙

醚液，殘渣置水浴上揮盡乙醚，加入80%乙醇200ml，加熱回流2h，趁熱濾過，用80%熱

乙醇50mL分次洗滌濾渣和濾器，濾渣連同濾紙置燒瓶中，加入水200mL，加熱回流3h，

趁熱過濾，用少量熱水洗滌濾器，合并濾液和洗液，置旋轉蒸發儀上濃縮至約5mL，用水

15mL轉移至離心瓶中，加無水乙醇80mL充分混勻，4℃靜置12h，以4000r/min離心10

min，棄去上清液，將殘余物溶解在熱水中并定量轉移至10mL容量瓶中，冷卻至室溫，用

水稀釋至刻度，并充分混合，轉移至離心管中，以4000r/min離心10min。取上清液2.0mL

，置5mL量瓶中，加入4moL/L三氟乙酸溶液1.0mL，100℃水解3h，冷卻至室溫，加入4

moL/L氫氧化鈉溶液1.0mL，用水定容至刻度，搖勻。取溶液1.0mL，置樣品瓶中，加入

內標使用溶液0.1mL，加0.4moL/L氫氧化鈉溶液0.5mL，加0.5moL/L的PMP甲醇溶液1.0

mL，80℃加熱60min，冰水浴中放置10min，加入0.4moL/L鹽酸溶液0.5mL中和，混勻，

轉移至離心管中，加入甲苯4mL，充分振搖后，4000r/min離心10min，取下層溶液，用

0.45μm的濾膜過濾，取續濾液即得。

8高效液相色譜參考條件

色譜柱：WatersXTERRAC18（3.5μm，4.6mm×250mm）或性能相當者。

流動相：乙腈-pH6.5磷酸鹽緩沖液（16:84）。

柱溫：30℃。

檢測波長：250nm。

進樣體積：20μL。

流速：按表1進行洗脫。

表1程序洗脫表

時間（min）流速（mL/min）

01.0

131.0

180.7

800.7

851.0

1301.0

9標準曲線的制作

分別精密量?。?.5）項下的混合標準儲備溶液0.05mL、0.1mL、0.3mL、0.5mL、0.6

mL、0.8mL，置樣品瓶中，分別加水使成1mL，加入內標使用溶液0.1mL，加0.4moL/L

氫氧化鈉溶液0.5mL，加0.5moL/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）甲醇溶液1.0mL，

80℃加熱60min后，冰水浴中放置10min，加入0.4moL/L鹽酸溶液0.5mL中和，混勻，轉

移至離心管中，加入甲苯4mL，充分振搖后，4000r/min離心10min，取下層溶液，用0.45

μm的有機相濾膜過濾，即得系列線性測定混合標準使用溶液，取上述系列溶液按（8）項

下的方法測定，記錄峰面積，以對照品與內標物的峰面積比值X為橫坐標，以對照品與內

標物的質量比值Y為縱坐標，計算標準曲線或求線性回歸方程。

10測定

取平行兩份的供試品溶液測定，待測液中各單糖的響應值應在標準曲線范圍內。以相

對保留時間確定待測定成分峰，以內標法計算待測成分含量。同時做空白試驗。

11結果計算

試樣中甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖

、阿拉伯糖和巖藻糖的含量以質量分數ωi計，數值以毫克每克（mg/g）計，按式（1）計

算：

?×n×25

?=（1）

??

式（1）中：

ρ—標準曲線計算出樣液中甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖

、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖分別與內標2-脫氧-D-核糖的質量比；

n—內標的質量，單位為毫克（mg）；

m—試樣的質量，單位為克（g）；

25—稀釋倍數。

試樣中枸杞多糖的含量是甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖

、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖的含量之和，以質量分數ω計，數值以毫克每克（

mg/g）計，按式（2）計算：

10

?=??（2）

1

測定結果保留三位有效數字。

12色譜圖

多糖類混合標準品溶液及枸杞供試品色譜圖參見附錄A

13精密度

在重復性條件下，獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不超過算術平均值的5%。

附錄A

（資料性）

多糖類標準混合溶液色譜圖

*VWD1A,Wavelength=250nm(枸杞多糖陳歡\枸杞多糖2021-09-1610-00-44\枸杞多糖0000007.D-枸杞多糖陳歡\枸杞多糖2021-09-1610-00-44\枸杞多糖00000

mAU

200

150

100

50

0

020406080100120min

1234567891011

圖A.110種單糖混合標準使用溶液色譜圖

VWD1A,Wavelength=250nm(陳歡\枸杞多糖2021-07-0811-38-04\枸杞多糖0000024.D)

mAU

9

250

5

200

7

150

6

11

3

1008

4

2

1

50

0

020406080100120min

圖2枸杞供試品溶液色譜圖

標引序號說明：

1-甘露糖；

2-核糖；

3-鼠李糖；

4-葡萄糖醛酸；

5-半乳糖醛酸；

6-葡萄糖；

7-半乳糖；

8-木糖；

9-阿拉伯糖；

10-巖藻糖；

11-2-脫氧-D-核糖（內標）

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》

的規定起草。

本文件由寧夏化學分析測試協會提出并歸口。

本文件起草單位：寧夏回族自治區藥品檢驗研究院、寧夏醫科大學、寧夏沃福百瑞枸杞產業股份有

限公司、寧夏醫科大學藥品質量檢測中心負責起草

本文件主要起草人：馬玲、馬學琴、陳歡、楊玲玲、馬宗衛、郭榮、梁建寧、蘇曉娟、劉淑瑛、臧

婭妮、王迎利、李艷婷、趙小軍、趙茜、任如如、撖志明。

本文件為首次發布。

枸杞中枸杞多糖含量的測定高效液相色譜法

1范圍

本文件規定了枸杞中枸杞多糖含量的高效液相色譜測定方法。

本文件適用于枸杞子及其制品中多糖類物質：甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、

半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖含量的測定。

2規范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注

日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用本文件；不注日期的引用文件，其最新版

本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法。

3術語和定義

本文件沒有需要界定的術語和定義。

4原理

試樣中的多糖類物質先用乙醚和80%的乙醇脫脂和脫色素，再用熱水提取后用無水乙

醇沉淀多糖，醇沉多糖再用水溶解后以4moL/L三氟乙酸溶液水解為單糖，再加PMP衍生

化，溶液用微孔濾膜過濾后，用高效液相色譜法測定，內標法定量。

5試劑與材料

除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規定的一級水。

5.1甲醇、乙腈：色譜純，

5.2標準品：D-甘露糖（SLBX3678V，Sigma，CAS號3458-28-4）；D-核糖（

WXBB0660，99%，Sigma，CAS號50-69-1）；L-鼠李糖（BCBD1986V，≥99.0%，

Sigma，CAS號10030-85-0）；D-葡糖糖醛酸（SLBH6139V，≥98.0%，Sigma，CAS

號6556-12-3）；D-一水合半乳糖醛酸（BCBX5194，≥97.0%，Sigma，CAS號

91510-62-2）；D-葡萄糖（LRAB8922，Sigma，CAS號50-99-7）；D-半乳糖（

SLBM8792V，≥99.0%，Sigma，CAS號59-23-4）；D-木糖（SLBN4994V，≥99.0%

，Sigma，CAS號58-86-6）；D-阿拉伯糖（BCBV0384，≥99.0%，Sigma，CAS號

10323-20-3）；L-巖藻糖（SLBH8792V，≥99.0%，Sigma，CAS號2438-80-4）；2-

脫氧-D-核糖（20200619，含量：98.0%，國藥集團化學試劑有限公司，CAS號50-

69-1）；D-阿洛糖（C10055777，98.0%，Macklin，CAS號2595-97-3）；2-氨基-2-

脫氧-D-半乳糖鹽酸鹽（20150226，98.0%，國藥集團化學試劑有限公司，CAS號