CN114931633B 一種來源于預(yù)激活抗原提呈細(xì)胞的自身免疫疾病疫苗的制備方法及其應(yīng)用 （蘇州爾生生物醫(yī)藥有限公司）

桑田街218號生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)園二期樂pulsedwithantigen-specific一種來源于預(yù)激活抗原提呈細(xì)胞的自身免本發(fā)明涉及一種來源于預(yù)激活抗原提呈細(xì)呈細(xì)胞細(xì)胞膜制備成納米囊泡或細(xì)胞膜組分負(fù)疫苗負(fù)載廣譜多樣的癌細(xì)胞抗原的同時克服了23S1、將抗原提呈細(xì)胞與負(fù)載自身免疫疾病全或?qū)㈩A(yù)激活的抗原提呈細(xì)胞的細(xì)胞膜組分和含有自身免疫疾病抗原細(xì)胞的細(xì)胞膜組所述第一遞送粒子或第二遞送粒子分別獨立地為納米粒子或微所述自身免疫疾病全細(xì)胞抗原由以下步驟制備得到：將含有自身免疫4HCO348.權(quán)利要求7所述的自身免疫疾病疫苗在制備用于治療或預(yù)防自身免疫疾病藥物中的5能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受的疫苗是實現(xiàn)上述目的主要方法之一。由于β細(xì)胞主要是由效應(yīng)性T細(xì)胞(Teff)攻擊的，所以誘導(dǎo)能夠和效應(yīng)性T細(xì)胞識別相同抗原但是對效應(yīng)性T細(xì)胞[0003]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種來源于被納米粒子和/或微米粒子激活[0004]本發(fā)明提供了一種來源于預(yù)激活抗原提呈細(xì)胞的自身免[0007]或?qū)㈩A(yù)激活的抗原提呈細(xì)胞的細(xì)胞膜組分負(fù)載在負(fù)載自身免疫疾病全細(xì)胞抗原6時負(fù)載抗原提呈細(xì)胞的膜組分和含有自身免疫疾病抗原的細(xì)胞的膜組分(以下均以β細(xì)胞[0014](1)將一種或多種抗原提呈細(xì)胞與負(fù)載自身免疫疾病全細(xì)胞抗原的納米粒子和/[0017](4)將步驟(2)和(3)得到的產(chǎn)物與負(fù)載自身免疫疾病全細(xì)胞抗原的第二遞送粒子胞集落刺激因子(GM_CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M_CSF)、活化素(activins)、抑制素7[0040]進(jìn)一步地，第一遞送粒子或第二遞送粒子的內(nèi)部和/或表面負(fù)載有抑制免疫的物4HCO3[0044]本發(fā)明還提供一種上述自身免疫疾病疫苗在制備用于治療或預(yù)防自身免疫疾病8[0051]進(jìn)一步地，負(fù)載于納米粒子或微米粒子表面的水溶性抗原和/或非水溶性抗原負(fù)載后為一層或多層，表面負(fù)載多層水溶性抗原和/或非水溶性抗原時，層與層之間為修飾原的細(xì)胞或組織的全細(xì)胞抗原的納米粒子和/或微米粒子激活抗原提呈細(xì)胞，從而使抗原和/或與粒子共作用的方法處理制備成納米疫苗或微米疫苗，所得納米疫苗或微米疫苗負(fù)[0055](1)疫苗中可以將一種或多種抗原提呈細(xì)胞的組分與自身免疫疾病的抗原表位整9[0056](2)納米疫苗或微米疫苗中可以含有包括DC細(xì)胞在內(nèi)一種或多種抗原提呈細(xì)胞的[0057](3)使用負(fù)載含有自身免疫疾病抗原的細(xì)胞和/或組織的全細(xì)胞抗原的納米粒子米疫苗可以負(fù)載用于激活抗原提呈細(xì)胞的納米粒和/或微米粒子所負(fù)載的全部抗原表位，[0059](5)將具有細(xì)胞活性的抗原提呈細(xì)胞處理后制備成無任何細(xì)胞活性的納米疫苗或[0060](6)本發(fā)明在將抗原提呈細(xì)胞的膜組分包裹于遞送粒子上的基礎(chǔ)上，還將含有自[0061]上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚制備納米粒子或微米粒子的示意圖；b為采用含有溶解劑的溶解液溶裂解和溶解含有自身免疫疾病抗原的細(xì)胞或組織的細(xì)胞全細(xì)胞抗原并制備納米粒子或微米粒子的示意圖；c為[0064]圖2_15分別為實施例1_14中用納米疫苗或微米疫苗預(yù)防或治療I型糖尿病等自身[0066]本發(fā)明所述的用于預(yù)防或治療I型糖尿病等自身免疫疾病的納米疫苗或微米疫微米粒子激活的抗原提呈細(xì)胞制備所得的納米疫苗或微米疫苗。納米粒子和/或微米粒子[0067]在制備用于激活抗原提呈細(xì)胞的負(fù)載含有自身免疫疾病抗原的細(xì)胞和/或腫瘤組[0068]在使用納米粒子或微米粒子體外激活抗原提呈細(xì)胞時，可以使用細(xì)胞因子和/或備是也可以采用其他可以將活的抗原提呈細(xì)胞制備成不具有細(xì)胞活性的納米疫苗或微米[0070]在一些實施方案中，采用負(fù)載含有自身免疫疾病抗原的細(xì)胞和/或組織全細(xì)胞抗原的納米粒子或微米粒子激活的抗原提呈細(xì)胞后將抗原提呈細(xì)胞制備成納米疫苗或微米[0071]步驟1，將第一預(yù)定體積的含有第一預(yù)定濃度的水相溶液加入第二預(yù)定體積的含裂解物中的各組分在制備時分別為水溶性抗原或是溶于尿素或鹽酸胍等溶解劑中的原非定濃度要求蛋白質(zhì)多肽濃度含量大于1ng/mL，能負(fù)載足夠細(xì)胞全細(xì)胞抗原以激活相關(guān)細(xì)解物中的各組分在制備時分別為水溶性抗原或者是溶于尿素或鹽酸胍等溶解劑中的原非免疫抑制劑在初始水相中的濃度為大于0.01ng[0074]在一些實施例中，制備粒子原材料為聚乳酸一羥基乙酸共聚物(PLGA)或聚乳酸[0076]實際中，有機(jī)相的第二預(yù)定體積根據(jù)其和水相的第一預(yù)在本發(fā)明中，水相的第一預(yù)定體積和有機(jī)相的第二預(yù)定體積之比的范圍為1:1.1_1:5000，體積與第二預(yù)定體積之比進(jìn)行調(diào)整以調(diào)整制備的納米?；蚯芯|(zhì)機(jī)時轉(zhuǎn)速大于100rpm，比如1000rpm～5000rpm；使用微流控處理流速大于0.01mL/min,比如0.1mL/min_100mL/min。超聲或者攪拌或者均質(zhì)處理或者微流控處理進(jìn)行納米化和/或微米化，超聲時間長短或攪拌速度或均質(zhì)處理壓力及時間能控制制備的微納粒子大劑的水溶液中并進(jìn)行大于2秒的超聲處理或大于1分鐘的攪拌或進(jìn)行均質(zhì)處理或微流控處在本發(fā)明中，超聲時間大于0.1秒，比如2～200秒，攪拌速度大于50rpm，比如50rpm~處理時使用高壓/超高壓均質(zhì)機(jī)或高剪切均質(zhì)機(jī)，使用高壓/超高壓均質(zhì)機(jī)時壓力大于20psi，比如20psi～100psi，使用高剪切均質(zhì)機(jī)時轉(zhuǎn)速大于1000rpm，比如1000rpm~施過程中為了控制納米粒子或微米粒子的尺寸可以對第三預(yù)定體積和第四預(yù)定體積之比[0086]在本發(fā)明一些實施方案中，步驟5所得沉淀重新混懸于第六預(yù)定體積的PBS(或生理鹽水)中時不需要凍干，可直接進(jìn)行后續(xù)納米粒子或微米粒子表面吸附癌細(xì)胞裂解物的[0087]在本發(fā)明一些實施方案中，步驟5所得沉淀重新混懸于含有凍干保護(hù)劑的水溶液[0091]步驟7，將第六預(yù)定體積的步驟5中得到的重懸于PBS(或生理鹽水)中的含納米粒的混懸液或者采用第六預(yù)定體積的PBS(或生理鹽水)重懸步驟6得到的冷凍干燥后的含有含有組織裂解物中的水溶性抗原或者溶解的原非水溶性抗原的體積與為1mL。在實際使用[0094]步驟8，將抗原提呈細(xì)胞與上述制備的納米粒子和/或微米粒子共孵育一定時制備納米粒子和/微米粒子的組織和/或細(xì)胞與抗原提呈細(xì)胞可以來自于自體或者同種異[0096]步驟10，將機(jī)械處理后的抗原提呈細(xì)胞和/或含有自身抗原的細(xì)胞樣品進(jìn)行梯度的含有細(xì)胞全細(xì)胞抗原中水溶性和/或非水溶性抗原的溶液中，或者將剩下的沉淀物重新混懸于第五預(yù)定體積的第五預(yù)定濃度的含有細(xì)胞全細(xì)胞抗原中水溶性和/或非水溶性抗原或礦化處理試劑,作用一定時間后離心洗滌，然后加入第七預(yù)定提交的含有帶正電或者帶[0101]在本發(fā)明一些實施方案中，步驟6所得沉淀重新混懸于第七預(yù)定體積的帶電物質(zhì)后可不需要凍干，可直接進(jìn)行后續(xù)納米粒子或微米粒子表面負(fù)載細(xì)胞/組織裂解物的相關(guān)[0102]在本發(fā)明一些實施方案中，步驟6所得沉淀重新混懸于含有干燥保護(hù)劑的水溶液[0105]步驟8，將第八預(yù)定體積的步驟6中得到的重懸于PBS(或生理鹽水)中的含納米粒的混懸液或者采用第八預(yù)定體積的PBS(或生理鹽水)重懸步驟7得到的干燥后的含有納米非水溶性抗原混合后使用。[0106]在本發(fā)明中，步驟5_步驟8的修飾和抗原負(fù)載步驟可重復(fù)多次以提高抗原的負(fù)載含有組織裂解物中的水溶性抗原或者原非水溶性抗原的體積與為0.1_100mL。在實際使用[0108]步驟9，將抗原提呈細(xì)胞與上述制備的納米粒子和/或微米粒子共孵育一定時制備納米粒子和/微米粒子的組織和/或細(xì)胞與抗原提呈細(xì)胞可以來自于自體或者同種異[0110]步驟11，將機(jī)械處理后的抗原提呈細(xì)胞和/或含有自身抗原的細(xì)胞樣品進(jìn)行梯度材料，以雷帕霉素為免疫抑制劑采用溶劑揮發(fā)法制備負(fù)載有β細(xì)胞的水溶性組分和非水溶鈉)溶解沉淀部分即可將NIT_1β細(xì)胞中不溶于純水的非水溶性組分轉(zhuǎn)化為在8M尿素水溶液10mL含4％海藻糖的超純水重懸后冷凍干燥48h，在使用前將20mg凍干的納米粒子重懸于[0120]將負(fù)載來源于β細(xì)胞全細(xì)胞抗原的納米粒子(500μg，其中負(fù)載水溶性組分的納米粒子250μg，負(fù)載非水溶性組分的納米粒子250μg)或空白納米粒(500μg)+游離裂解液與7000g離心20分鐘后收集上清液后使用0.22μm的濾膜過濾擠出后收集濾液，100μLPBS，連續(xù)給6周。各組小鼠從第8周開始每天記錄小鼠血糖情況。以血糖高于的納米粒子激活的抗原提呈細(xì)胞制備的納米疫苗1處理的小鼠，在25周后只有約40％小鼠提呈細(xì)胞制備的納米疫苗對I型糖尿病具有良好預(yù)防效果，且預(yù)防效果優(yōu)于納米粒子激活述所得來源于細(xì)胞裂解物的水溶性組分和溶解于脫氧膽酸鈉中的原非水溶性組分按質(zhì)量料PLGA分子量為24KDa_38KDa，所采用的免疫抑制劑為雷帕霉素和他克莫司混合免疫抑制PLGA微米疫苗約負(fù)載90μg蛋白質(zhì)或多肽組分，每1mgPLGA微米疫苗所負(fù)載的雷帕霉素和他同，負(fù)載等量雷帕霉素和他克莫司但是不負(fù)載任何裂解后的水溶性組分和非水溶性組分。劑。[0137]將負(fù)載全細(xì)胞抗原的微米粒子(500μg)或多肽微米粒子(500μg)或空白微米粒(500μg)+游離裂解液與BMDC(500萬個)和B細(xì)胞(500萬個)在15mL高糖DMEM完全培養(yǎng)基中共孵育72小時(37℃,5％CO2)，孵育體系中含有GM_CSF(2000U/mL)、IL_2(200U/mL)、IL_7[0139]通過在400g離心5分鐘收集孵育后的抗原提呈細(xì)胞，然后使用含有蛋白酶抑制劑的4℃磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌細(xì)胞兩遍，將細(xì)胞重懸在PBS水中后在4℃低功率(20W)超CD4抗體、CD25抗體、Ly49抗體和FOXP3抗體，爾后流式細(xì)胞術(shù)分析T細(xì)胞亞群中CD4+CD25+FOXP3+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例和CD8+Ly49+T占CD8+T細(xì)胞的比例。微米粒子所負(fù)載的β細(xì)胞全細(xì)胞抗原在被抗原提呈細(xì)胞B細(xì)胞吞噬后可被降解成抗原表位被提呈到抗原提呈細(xì)胞表面，可以識別β細(xì)胞全細(xì)胞抗原的特異性T細(xì)胞即可以識別β細(xì)胞全細(xì)胞抗原表位后被激活并高表達(dá)特異性表面標(biāo)志物。使用流式細(xì)胞術(shù)分析的高表達(dá)特定標(biāo)志物的T細(xì)胞即為調(diào)呈細(xì)胞制備的納米疫苗處理的小鼠在25周后有50％患有糖尿病。在采用負(fù)載β細(xì)胞全細(xì)胞抗原的微米粒子激活的抗原提呈細(xì)胞制備的微米疫苗處理的小鼠在25周后只有約30％小CD8+Ly49+T細(xì)胞和CD4+CD25+FOXP3+T細(xì)胞分別占CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的比例明顯高于負(fù)載多肽的微米粒子和空白微米粒子+游離裂解液激活的DC+B細(xì)胞制備的納米疫苗所誘導(dǎo)的米疫苗可以更好的激活具有識別和抑制Teff的β細(xì)胞特異性[0148]本實施例以小鼠胰島組織裂解物全細(xì)胞組分和β細(xì)胞裂解物全細(xì)胞組分混合物制[0150]處死小鼠后收集小鼠胰島組織，將胰島組織通過細(xì)胞過濾網(wǎng)后制備成單細(xì)胞懸[0151]在高糖DMEM完全培養(yǎng)基(葡萄糖含量為正常含量的4倍)中培養(yǎng)NIT_1細(xì)胞24小的水溶性組分。將沉淀部分使用8M尿素水溶液(含500mM氯化鈉)溶解即為溶解劑溶解后的非水溶性組分。高葡萄糖條件和使用毒胡蘿卜素[0152]上述來源于β細(xì)胞裂解物的水溶性組分和來源于胰島組織裂解物的水溶性組分按島組織裂解物的非水溶性組分按質(zhì)量比1:1混合后即為非水溶性組分混合物；將水溶性組前將其用9mLPBS重懸然后加入1mL的裂解液組分(蛋白質(zhì)濃度80mg/mL)并室溫作用10min，得到內(nèi)外都負(fù)載全細(xì)胞裂解物組分的微米粒子系統(tǒng)。所得微米粒子平均粒徑為2.55μm左[0156]本實施例使用來源于外周血的DC細(xì)胞以及B細(xì)胞作為抗原提呈細(xì)胞。處死小鼠后從小鼠PBMC中分選出CD19+B細(xì)胞和CD11c+DC,將上述B細(xì)胞和DC按數(shù)量比1:1混合即為所用中含500萬個DC和500萬個B細(xì)胞)在15mL高糖DMEM完全培養(yǎng)基中共孵育72小時(37℃,5%CO2)，孵育體系中含有細(xì)胞因子組合1:TGF_β(2000U/mL)、IL_4(200U/mL)、IL_7(1000U/[0159]或者將負(fù)載全細(xì)胞抗原的微米粒子(500μg)與混合抗原提呈細(xì)胞(共1000萬個細(xì)5％CO2)，孵育體系中含有細(xì)胞因子組合2:TNF_a(2000U/mL)、IL_12(200U/mL)、IL_6在15mL高糖DMEM完全培養(yǎng)基中孵育72小時(37℃,5％CO2)，孵育體系中含有細(xì)胞因子組合[0162]通過在300g離心4分鐘收集步驟(4)激活后的混合抗原提呈細(xì)胞(1000萬個，其中淀收集上清液，將上清液與濾液與步驟(2)制備的微米粒子(80mg)混合后在20W超聲處理3合抗原提呈細(xì)胞共孵育過程中加入細(xì)胞因子組合1所激活的混合抗原提呈細(xì)胞所制備的微細(xì)胞因子組合2所激活的混合抗原提呈細(xì)胞所制備的微米疫苗為微米疫苗2，粒徑酶抑制劑的4℃磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌細(xì)胞兩遍，將細(xì)胞重懸在PBS水中后在低功率粒子(80mg)混合后在20W超聲處理3分鐘后共孵育15分鐘后使用5μm的濾膜過濾擠出后收集+250萬個B細(xì)胞)和NIT_1細(xì)胞(500萬個)并混合，然后使用含有蛋白酶抑制劑的4℃磷酸鹽理3分鐘后共孵育15分鐘后使用5μm的濾膜過濾擠出后收集濾液，然后將濾液在8000g離心和FOXP3抗體，爾后流式細(xì)胞術(shù)分析T細(xì)胞亞群中CD4+細(xì)胞吞噬后可被降解成抗原表位被提呈到抗原提呈細(xì)胞表面，可以識別β細(xì)胞全細(xì)胞抗原苗3處理組小鼠在25周后有約30％小鼠患有I型糖尿?。晃⒚滓呙?處理組小鼠在25周后有粒子激活的混合抗原提呈細(xì)胞細(xì)胞膜組分，可以明顯提高疫苗預(yù)防I型糖尿病的功效；而且，粒子表面負(fù)載有含有I型糖尿病相關(guān)抗原的細(xì)胞的細(xì)胞膜組分也可以提高微米疫苗預(yù)的細(xì)胞膜組分時預(yù)防I型糖尿病的效果最佳。微米疫苗1明顯優(yōu)于微米疫苗3說明在將抗原提呈細(xì)胞細(xì)胞膜組分負(fù)載在粒子表面前將抗原提呈細(xì)胞使用負(fù)載細(xì)胞全細(xì)胞抗原的粒子粒子激活混合抗原提呈細(xì)胞時加入特定細(xì)胞因子有助于提高抗原提呈細(xì)胞細(xì)胞膜所制備reg[0171]如圖4b和4c所示，微米疫苗1所能誘導(dǎo)的自身抗原特異性T多于微米疫苗2和微regregreg[0173]本實施例使用了高葡萄糖條件和使用毒胡蘿卜素增加含有與自身免疫疾病抗原[0175]本實施例以小鼠I型糖尿病模型來說明如何使用抗原提呈細(xì)胞來源的納米疫苗預(yù)例中采用了硅化和添加帶電物質(zhì)的方法來增加抗原的負(fù)載量，且只進(jìn)行了一輪礦化處理。培養(yǎng)基中孵育30min,然后通過細(xì)胞過濾網(wǎng)制備單細(xì)胞懸液，并加入適量純水并反復(fù)凍融5上清液即為可溶于純水的水溶性抗原；在所得沉淀部分中加入10％的十二烷基硫酸鈉(SDS)水溶液溶解沉淀部分即可將不溶于純水的非水溶性抗原轉(zhuǎn)化為在10％SDS水溶液中10000g離心20分鐘，然后使用7mLPBS重懸納米粒子并與3mL含有細(xì)胞裂解物(60mg/mL)的純水離心洗滌后使用3mL含魚精蛋白(5mg/mL)和聚賴氨酸(10mg/mL)的PBS重懸并作用10min,然后10000g離心20min洗滌，采用10mL含有裂解物(50mg/mL)的PBS溶液重懸并作用粒子使用前將其用7mLPBS重懸然后加入3mL的裂解液組分(蛋白質(zhì)濃度50mg/mL)并室溫作[0180]對照多肽納米粒子的制備材料和制備方法相同，負(fù)載四種質(zhì)量等量的β細(xì)胞多肽為InsulinB9_23,InsulinA14_20,IGRP2吹打，使細(xì)胞團(tuán)塊分散，然后使用70μm細(xì)胞濾器將細(xì)胞過篩，轉(zhuǎn)移至15mL離心管內(nèi)，棄上清用冷的配置好的骨髓巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含有15％L929培養(yǎng)基的DMEM高糖培養(yǎng)[0187]將負(fù)載全細(xì)胞抗原的納米粒子(500μg)或多肽納米粒(500μg)或空白納米粒(500μg)+游離裂解液與制備的DC(500萬個)和BMDM細(xì)胞(500萬個)在15mLRPMI1640完全培養(yǎng)基中共孵育24小時(37℃,5％CO2)，孵育體系中含有粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM_[0189]通過在400g離心5分鐘收集孵育后的DC和BMDM，然后使用含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的4℃磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌細(xì)[0193]如圖5所示，PBS或者空白微米粒+細(xì)胞裂解物激活的抗原提呈細(xì)胞制備的納米疫胞抗原的納米粒子激活的抗原提呈細(xì)胞制備的納米疫苗處理的小鼠在25周后只有約30%公藤為免疫抑制劑制備負(fù)載有β細(xì)胞全細(xì)胞抗原的納米粒子。使用納米粒子激活抗原提呈[0199]本實施例中納米粒子采用復(fù)乳法制備。所采用的納米粒子制備材料PLA分子量為[0203]將負(fù)載全細(xì)胞抗原的微米粒子(500μg)與BMDC(1000萬個)在20mL高糖DMEM完全培養(yǎng)基中共孵育72小時(37℃,5％CO2)，孵育體系中含有TGF_β(1000U/mL)、IL_10(2000U/[0205]通過在400g離心5分鐘收集孵育后的BMDC(1000萬個)，然后使用含有蛋白酶抑制劑的4℃磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌細(xì)胞兩遍，將細(xì)胞重懸在PBS水中后在4℃使用超聲(20W)處理1分鐘，然后使用高壓均質(zhì)機(jī)(工作壓力5MPa)均質(zhì)處理1分鐘。然后將樣品在1000g離心15分鐘并收集上清液，然后在6000g離心15分鐘后棄去沉淀，收集上清液后在16000g離心90分鐘后棄去上清液并收集沉淀，將沉淀重懸后與步驟(2)制備的負(fù)載全細(xì)胞抗原的納米粒子(50mg)混合后在10W超聲30秒后共孵育15分鐘后使用0.45μm的濾膜過濾擠[0206]通過在400g離心5分鐘收集孵育后的BMDC(1000萬個)，然后使用含有蛋白酶抑制劑的4℃磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌細(xì)胞兩遍，將細(xì)胞重懸在PBS水中后在4℃使用超聲(20W)處理1分鐘，然后使用高壓均質(zhì)機(jī)(工作壓力5MPa)均質(zhì)處理1分鐘。然后將樣品在1000g離心15分鐘并收集上清液，然后在6000g離心15分鐘后棄去沉淀，收集上清液后在16000g離心90分鐘后棄去上清液并收集沉淀，將沉淀使用PBS重懸后即可得只含有被激活苗1處理的小鼠在25周后有20％患有糖尿病。這說明納米疫苗1優(yōu)于納米疫苗2和納米疫苗3，內(nèi)部負(fù)載癌細(xì)胞全細(xì)胞抗原和表面負(fù)載被激活抗原提呈細(xì)胞的細(xì)胞膜組分都有利于提2表面都負(fù)載有MHC分子與抗原多肽結(jié)合后的復(fù)合物。具有膜結(jié)構(gòu)的納米疫苗1既可以直接將NaiveT細(xì)胞誘導(dǎo)成具有負(fù)向調(diào)節(jié)功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)，也可以被抗原提呈細(xì)胞吞regreg用納米粒子激活抗原提呈細(xì)胞后利用抗原提呈細(xì)胞制備納米疫苗用于預(yù)防自身免疫疾病_[0216]本實施例中納米粒子采用溶劑揮發(fā)法制備。所采用的納米粒子制備材料PLA分子納米粒子負(fù)載四種等質(zhì)量的抗原多肽(InsulinB9_23,InsulinA14_20,IGRP206_214,從淋巴結(jié)細(xì)胞單細(xì)胞懸液中分選出CD11c+DC和CD19+[0220]將負(fù)載全細(xì)胞抗原的納米粒子(500μg)或多肽納米粒(500μg)與DC(500萬個)和B細(xì)胞抗原的納米粒子(500μg)與DC(1000萬個)在20mL高糖DMEM完全培養(yǎng)基中共孵育72小時[0222]通過在400g離心5分鐘收集孵育后的DC(500萬個)和B細(xì)胞(500萬個)或者只收集DC細(xì)胞(1000萬個)，然后使用含有蛋白酶抑制劑的4℃磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌細(xì)胞兩得上清液與步驟(2)所制備的相對應(yīng)的激活抗原提呈細(xì)胞的納米粒子(20mg)混合后在[0226]如圖7所示，PBS或者空白微米粒+細(xì)胞裂解物激活的抗原提呈細(xì)胞制備的納米疫苗處理的小鼠在25周后有70％_80％患有I型糖尿?。患{米疫苗預(yù)防處理的小鼠患有I型糖粒子激活的DC和B細(xì)胞混合制備的納米疫苗效果優(yōu)于負(fù)載癌細(xì)胞全細(xì)胞抗原的納米粒子激好。這可能是因為激活的B細(xì)胞內(nèi)的一部分組分包含進(jìn)抗原提呈細(xì)胞制備的納米疫苗后可[0228]本實施例以I型糖尿病為模型來說明如何使用被納米粒子激活的抗原提呈細(xì)胞制即為可溶于純水的水溶性組分；在所得沉淀部分中加入含有8M尿素和2％精氨酸的水溶液分和非水溶性組分按質(zhì)量比1:1混合即為制備納米粒子的原[0232]本實施例中納米粒采用溶劑揮發(fā)法制備。所采用的納米粒子制備材料PLA分子量為20KDa，所采用的免疫抑制劑為雷帕霉素和胍立莫司，且免疫抑制劑分布于納米粒子內(nèi)用10mL含4％海藻糖的超純水重懸后冷凍干燥48h。使用前將20mg納米粒重懸于0.9mLPBS粒子平均粒徑為280nm左右，納米粒子表面電位為_3mV左右；每1mgPLGA納米粒子約負(fù)載用流式細(xì)胞術(shù)從PBMC中分選出CD11c+DC。本實施例中同時使用DC和BMDM作為抗原提呈細(xì)[0236]將負(fù)載細(xì)胞全細(xì)胞抗原的納米粒子(1000μg)與外周血來源的DC(500萬個)和BMDM(500萬個)在20mLRPMI1640完全培養(yǎng)基中共孵育48小時(37℃,5％CO2)，或者將負(fù)載癌細(xì)胞全細(xì)胞抗原的納米粒子(500μg)與外周血來源的DC(1000萬個)在RPMI1640完全培養(yǎng)基中[0238]通過在400g離心5分鐘收集孵育后的外周血來源的DC(500萬個)及BMDM(500萬個)或者只收集外周血來源的DC(1000萬個)，然后使用含有蛋白酶抑制劑的4℃磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌細(xì)胞兩遍，將細(xì)胞重懸在PBS水中后在高壓均質(zhì)機(jī)中(5000bar)中處理5分鐘。然后將樣品在2000g離心15分鐘并收集上清液，將上清液在8000g離心15分鐘后收集上清的DC制備的納米疫苗，說明多種被納米粒子激活的抗原提呈細(xì)胞制備的納米疫苗效果更[0244]本實施例以I型糖尿病為模型來說明如何使用負(fù)載β細(xì)胞全細(xì)胞抗原的納米粒子[0246]收集培養(yǎng)的NIT_1細(xì)胞，將NIT_1細(xì)胞使用8M尿素水溶液(含500mM氯化鈉)中裂解后用8M尿素水溶液溶解裂解物組分即為制燥48h后備用。該納米粒子平均粒徑為360nm左右，納米粒子表面電位為_5mV左右；每1mg[0253]將負(fù)載全細(xì)胞抗原的納米粒子(800μg)或者空白納米粒子(800μg)+等量游離裂解液與外周血來源的DC(800萬個)和BMDC(800萬個)在15mL高糖DMEM完全培養(yǎng)基中共孵育48[0255]通過在400g離心5分鐘收集孵育后的外周血來源的DC(800萬個)和BMDC(800萬實施例1中步驟2所制備的相應(yīng)的納米粒子(50mg)以及DSPE_PEG_CD32單抗在10W超聲處理22所制備的相應(yīng)的納米粒子(50mg)在10W超聲處理2分鐘后使用0.45μm的濾膜過濾擠出后收[0261]本實施例以小鼠胰腺組織來說明如何制備負(fù)載有β細(xì)胞的胰腺組織全細(xì)胞抗原的于3000RPM的轉(zhuǎn)速離心5min取上清液即為組織細(xì)胞中可溶于純水的水溶性組分；在所得沉淀部分中加入8M尿素水溶液溶解沉淀部分即可將不溶于純水的原非水溶性組分轉(zhuǎn)化為在8M尿素水溶液中可溶。將水溶性組分和溶解于8M尿素中的原非水溶性組分按照質(zhì)量比1:1TGF_β的mRNA和雷帕霉素分布于微米粒子內(nèi)部，在制備時mRNA溶解于水相中而雷帕霉素溶解于有機(jī)相中。制備方法如前所述，微米粒子平均粒徑為1.5μm左右，表面電位Zeta[0269]將負(fù)載細(xì)胞全細(xì)胞抗原的微米粒子(1000μg)或空白微米粒子(1000μg)與BMDC(1000萬個)在15mL高糖DMEM完全培養(yǎng)基中共孵育48小時(37℃,5％CO2)；或者將負(fù)載全細(xì)胞抗原的微米粒子(1000μg)與B細(xì)胞(1000萬個)在15mL高糖DMEM完全培養(yǎng)基中共孵育72小4℃磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌細(xì)胞兩遍，將細(xì)胞重懸在PBS水中后在4℃低功率(10W)超聲[0277]本實施例以I型糖尿病為模型來說明如何使用負(fù)載β細(xì)胞全細(xì)胞抗原的納米粒子水溶性組分按質(zhì)量比1:1混合即為制備對照納米粒子的[0280]在高糖培養(yǎng)基中將葡萄糖含量增加一倍，并同時加入0.05μM/L毒胡蘿卜素(Thapsigargin)至培養(yǎng)基中孵育培養(yǎng)NIT_1細(xì)胞12小時。增加葡萄糖的含量或添加毒胡蘿純水的水溶性組分；在所得沉淀部分中加入8M尿素(含500mM氯化鈉)水溶液溶解沉淀部分即可將NIT_1細(xì)胞中不溶于純水的非水溶性組分轉(zhuǎn)化為在8M尿素水溶液中可溶。將上述水溶性組分和非水溶性組分按質(zhì)量比1:1混合即為制備激活抗原提呈細(xì)胞的納米粒子的抗原水重懸后冷凍干燥48h后備用。該納米粒子平均粒徑為260nm左右，納米粒子表面電位為_[0286]將負(fù)載全細(xì)胞抗原的納米粒子(800μg)與外周血來源的DC(800萬個)和BMDC(800萬個)在15mL高糖DMEM完全培養(yǎng)基中共孵育48小時(37℃,5％CO2)，孵育體系中含有IL_13[0288]通過在400g離心5分鐘收集孵育后的外周血來源的DC(800萬個)和BMDC(800萬(30mg)以及DSPE_PEG_CD32單抗(30μg)在1200RPM攪拌處理2分鐘后使用0.45μm的濾膜過濾添加化學(xué)物質(zhì)處理的β細(xì)胞制備的納米粒激活的抗原提呈細(xì)胞所制備的納米疫苗效果好于裂解物以大于100g的轉(zhuǎn)速離心1分鐘以上并取上清液即為NIT_1細(xì)胞可溶于純水的水溶性溶性組分按質(zhì)量比1:1混合即為制備對照納米粒子的水重懸后冷凍干燥48h后備用。該納米粒子平均粒徑為250nm左右，納米粒子表面電位為_[0301]將負(fù)載全細(xì)胞抗原的納米粒子(800μg)與外周血來源的DC(1000萬個)和BMDC(1000萬個)在15mL高糖DMEM完全培養(yǎng)基中共孵育48小時(37℃,5％CO2)，孵育體系中含有胞抗原的納米粒子(800μg)與外周血來源的DC(800萬個)和BMDC(800萬個)在15mL高糖DMEM抑制劑和蛋白酶抑制劑的存在下超聲機(jī)械破壞抗原提呈細(xì)胞。經(jīng)過離心后所獲細(xì)胞膜用抗原提呈細(xì)胞過程中加入細(xì)胞因子或抗體激活的抗原提呈細(xì)胞所制備的納米疫苗效果好于在納米粒激活的抗原提呈細(xì)胞過程中未加入任何細(xì)胞因子或抗體的抗原提呈細(xì)胞制備呈細(xì)胞激活過程中細(xì)胞因子和/或抗體的添加有助于提高被激活的抗原提呈細(xì)胞制備的納裂解物以大于100g的轉(zhuǎn)速離心1分鐘以上并取上清液即為NIT_1細(xì)胞可溶于純水的水溶性溶性組分按質(zhì)量比1:1混合即為制備對照納米粒子的料PLGA分子量為24KDa_38KDa，所采用的抑制劑為雷帕霉素和白介素2，使用KALA多肽[0316]將負(fù)載全細(xì)胞抗原的納米粒子(800μg)與外周血來源的DC(800萬個)和BMDC(800萬個)在15mL高糖DMEM完全培養(yǎng)基中共孵育48小時(37℃,5％CO2)，孵育體系中含有IL_13抑制劑和蛋白酶抑制劑的存在下超聲機(jī)械破壞抗原提呈細(xì)胞。經(jīng)過離心后所獲細(xì)胞膜用納米粒激活的抗原提呈細(xì)胞所制備的納米疫苗效果好于未負(fù)