PCR擴增檢測乙肝病毒課件

實驗三：PCR擴增檢測乙肝病毒1精選課件實驗三：PCR擴增檢測乙肝病毒1精選課

乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎，我國發病率很高，HBV的檢測極其重要。HBVDNA存在就可以引起乙肝的傳染，乙肝病毒基因是乙肝病毒的核心成分，是病毒復制的發動機。2精選課件乙肝病毒（HBV）感染引起的乙PCR技術可以檢測出極微量的病毒，是判斷其傳染性最直接、最可靠的證據。PCR技術已成為公認的對病毒性肝炎的診斷、療效觀察及預防研究工作最理想的方法之一。3精選課件PCR技術可以檢測出極微量的病毒，是判斷其一、實驗目的1.掌握PCR技術擴增的原理2.熟悉PCR擴增檢測乙肝病毒的基本操作過程。4精選課件一、實驗目的4精選課件二、實驗原理聚合酶鏈反應(PolymeraseChainReaction)簡稱PCR,是在體外條件下利用DNA聚合酶、催化一對引物間的特異性DNA片段合成的基因體外擴增技術，它包括三個基本過程：5精選課件二、實驗原理5精選課件1.變性：加熱使雙鏈DNA變為單鏈2.退火：急速降溫使引物和互補模板在局部形成雜交鏈3.延伸：耐熱DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物為起始點的延伸反應6精選課件1.變性：加熱使雙鏈DNA變為單鏈6精選課件模板DNA高溫變性低溫退火引物適溫延伸經過25-35次循環后，目的片段擴增2n倍兩條子代DNA一次循環Tap酶5’3’3’5’3’5’5’3’5’3’7精選課件模板DNA高溫變性低溫退火引物適溫延伸經過25-35次循環后三、主要器材及試劑1.主要器材：9700型PCR儀電泳槽、電泳儀8精選課件三、主要器材及試劑9700型PCR儀電泳槽、電泳儀8精選課件

紫外分析儀臺式高速離心機9精選課件

2.主要試劑：HBV-PCR定性檢測試劑盒PCR反應管HBV陽性標本DNA提取液10精選課件2.主要試劑：HBV-PCR定性檢測試劑盒PCR反應管HBV四、操作步驟1.標本處理：取患者血清40μl，加入DNA提取液40μl，沸水浴10分鐘，10000轉離心5分鐘，取上清液4μl做PCR反應。11精選課件四、操作步驟11精選課件2.加樣：加入提取好的標本4μl，6000轉離心10秒。取試劑盒中PCR反應管

TapDNA聚合酶10×擴增緩沖液

4種dNTP混合物引物(小分子DNA片段）

Mg2+12精選課件2.加樣：取試劑盒中PCR反應管TapD三個擴增步驟溫度及時間溫度時間變性93℃45″（首次5′）退火55℃45″延伸72℃60″（末次5′）循環次數：25次3.PCR儀上擴增：13精選課件三個擴增步驟溫度及時間PCR儀上擴增加入標本離心6000轉離心10秒14精選課件PCR儀上擴增加入標本離心6000轉離心10秒14精選課件4.電泳檢測：①制備2%瓊脂糖凝膠

2%瓊脂糖的制備：電泳槽的準備：稱取0.8g瓊脂糖40mlTBE電泳緩沖液（PH8.0)煮沸溶解加入冷卻60℃左右加入溴乙啶EB20μl倒膠15精選課件4.電泳檢測：2%瓊脂糖的制備：電泳槽的準備：稱取40mlT``②加樣：取擴增后的產物10ul點樣于凝膠孔取樣點樣16精選課件``②加樣：取擴增后的產物10ul點樣于凝膠孔取樣點樣16③電泳：點樣端接“-”，穩壓，50V，電泳30分鐘。五、結果觀察：紫外分析儀下觀察，出現橙黃色條帶則為HBV陽性HBV陽性HBV陰性HBV陽性對照HBV陰性對照正極負極點樣孔17精選課件③電泳：點樣端接“-”，穩壓，50V，電泳30分鐘。HBV陽五、注意事項1.試劑盒內陽性標本及DNA提取液使用前需充分融化離心。2.反應液的表面為固體封蓋劑，電泳取樣時從反應管底部吸液。3.EB為強致癌物，操作過程應注意防護。4.注意無菌操作，以免出現假陽性。18精選課件五、注意事項18精選課件Thankyou!19精選課件Thankyou!19精選課件此課件下載可自行編輯修改，供參考！感謝您的支持，我們努力做得更好！此課件下載可自行編輯修改，供參考！實驗三：PCR擴增檢測乙肝病毒21精選課件實驗三：PCR擴增檢測乙肝病毒1精選課

乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎，我國發病率很高，HBV的檢測極其重要。HBVDNA存在就可以引起乙肝的傳染，乙肝病毒基因是乙肝病毒的核心成分，是病毒復制的發動機。22精選課件乙肝病毒（HBV）感染引起的乙PCR技術可以檢測出極微量的病毒，是判斷其傳染性最直接、最可靠的證據。PCR技術已成為公認的對病毒性肝炎的診斷、療效觀察及預防研究工作最理想的方法之一。23精選課件PCR技術可以檢測出極微量的病毒，是判斷其一、實驗目的1.掌握PCR技術擴增的原理2.熟悉PCR擴增檢測乙肝病毒的基本操作過程。24精選課件一、實驗目的4精選課件二、實驗原理聚合酶鏈反應(PolymeraseChainReaction)簡稱PCR,是在體外條件下利用DNA聚合酶、催化一對引物間的特異性DNA片段合成的基因體外擴增技術，它包括三個基本過程：25精選課件二、實驗原理5精選課件1.變性：加熱使雙鏈DNA變為單鏈2.退火：急速降溫使引物和互補模板在局部形成雜交鏈3.延伸：耐熱DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物為起始點的延伸反應26精選課件1.變性：加熱使雙鏈DNA變為單鏈6精選課件模板DNA高溫變性低溫退火引物適溫延伸經過25-35次循環后，目的片段擴增2n倍兩條子代DNA一次循環Tap酶5’3’3’5’3’5’5’3’5’3’27精選課件模板DNA高溫變性低溫退火引物適溫延伸經過25-35次循環后三、主要器材及試劑1.主要器材：9700型PCR儀電泳槽、電泳儀28精選課件三、主要器材及試劑9700型PCR儀電泳槽、電泳儀8精選課件

紫外分析儀臺式高速離心機29精選課件

2.主要試劑：HBV-PCR定性檢測試劑盒PCR反應管HBV陽性標本DNA提取液30精選課件2.主要試劑：HBV-PCR定性檢測試劑盒PCR反應管HBV四、操作步驟1.標本處理：取患者血清40μl，加入DNA提取液40μl，沸水浴10分鐘，10000轉離心5分鐘，取上清液4μl做PCR反應。31精選課件四、操作步驟11精選課件2.加樣：加入提取好的標本4μl，6000轉離心10秒。取試劑盒中PCR反應管

TapDNA聚合酶10×擴增緩沖液

4種dNTP混合物引物(小分子DNA片段）

Mg2+32精選課件2.加樣：取試劑盒中PCR反應管TapD三個擴增步驟溫度及時間溫度時間變性93℃45″（首次5′）退火55℃45″延伸72℃60″（末次5′）循環次數：25次3.PCR儀上擴增：33精選課件三個擴增步驟溫度及時間PCR儀上擴增加入標本離心6000轉離心10秒34精選課件PCR儀上擴增加入標本離心6000轉離心10秒14精選課件4.電泳檢測：①制備2%瓊脂糖凝膠

2%瓊脂糖的制備：電泳槽的準備：稱取0.8g瓊脂糖40mlTBE電泳緩沖液（PH8.0)煮沸溶解加入冷卻60℃左右加入溴乙啶EB20μl倒膠35精選課件4.電泳檢測：2%瓊脂糖的制備：電泳槽的準備：稱取40mlT``②加樣：取擴增后的產物10ul點樣于凝膠孔取樣點樣36精選課件``②加樣：取擴增后的產物10ul點樣于凝膠孔取樣點樣16③電泳：點樣端接“-”，穩壓，50V，電泳30分鐘。五、結果觀察：紫外分析儀下觀察，出現橙黃色條帶則為HBV陽性HBV陽性HBV陰性HBV陽性對照HBV陰性對照正極負極點樣孔37精選課件③電泳：點樣端接“-”，穩壓，50V，電泳30分鐘。HB