CN119120431B 一種高效轉化高純度稀有人參皂苷ck的復合酶及其制備方法與應用 （谷雨生物科技集團股份有限公司）

388號22棟中科院長春應化所黃埔先KR20160014096A,2016.02.05一種高效轉化高純度稀有人參皂苷CK的復本發明涉及一種高效轉化高純度稀有人參具有協同增效將人參皂苷Rb1轉化為人參皂苷CK2A1、對來源于土壤中華單胞菌的β_葡萄糖苷酶進行密碼子優化，通過B2、當溶氧下降至60_70％時，調溫至23_27℃并開始補料，第一小時補料速度190_3.如權利要求1或2所述的復合酶，其特征在于13000U/g，所述果糖基轉移酶的酶活力為2500_3000U/g，所述乳糖酶的酶活力為5500_6000U/g，所述纖維素酶的酶活力為9000_10000U/g，所述β_葡聚糖酶的酶活力為6000_4.如權利要求1_3任一項所述的復合酶在制備人參皂苷C(3)以體積百分比為40_95％的乙醇溶液作為溶劑與步驟(2)所得沉淀B混合制備為復3(聶)在步驟(1)中，含有人參皂苷Rb1的提取物與復合酶的重量比為含有人參皂苷Rb14苷酶與濃度為10mg/mL人參皂苷Rb1反應生成人參皂苷CK，人參皂苷CK的轉化效率為62一[0006]本發明的目的在于克服現有技術的不足之處而提供一種高效轉化高純度稀有人56[0026]作為本發明所述復合酶的優選實施方式，所述β_葡萄糖苷酶的酶活力為12000_13000U/g，所述果糖基轉移酶的酶活力為2500_3000U/g，所述乳糖酶的酶活力為5500_6000U/g，所述纖維素酶的酶活力為9000_10000U/g，所述β_葡聚糖酶的酶活力為6000_[0027]作為本發明所述復合酶的優選實施方式，所述β_葡萄糖苷酶的酶活力為12000U/Rb1的提取物與磷酸緩沖液的重量比為含有人參皂苷Rb1的提取物：磷酸緩沖液＝1：(10_[0035](3)以體積百分比為40_95％的乙醇溶液作為溶劑與步驟(2)所得沉淀B混合制備7發明的轉化方法中當底物濃度為1％時，每1000g人參皂苷Rb1的提取物能夠獲得526g人參8酶和β_葡聚糖酶四種酶混合搭配使用，可以協同提高人參皂苷Rb1的轉化為人參皂苷CK的[0059]圖3為本發明效果例1中實施例1所得復合酶按照實施例4方法制備得到的人參皂[0060]圖4為本發明效果例3中不同人參皂苷CK的穩定性測試結果，圖中A為穩定性測試[0063]本發明所述含有人參皂苷Rb1的提取物的來源不作限定，只需明確其中含有人參9[0074]同源重組技術按照clonExpress8IIOneStepCloningKit(單片段)說明書進行，連接條件為37℃30min，clonExpre技股份有限公司提供，貨號為C112，經同源重組技術組裝所得的質粒或表達基因簇轉入照上述方法保存或活化備用。液為2×RapidTaqMasterMix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，貨號為P222_01，22[0111]1.5將步驟1.4所得1L二級種子液接種至50L發酵罐中，發酵罐裝有30L發酵培養[0125]本發明復合酶及其制備方法的兩種實施例，實施例3_4所述復合酶的組分及其用苷Rb1的提取物與1mM磷酸鈉緩沖液(pH＝7.0)在反應釜中按照200rpm的轉速混合，按照含有人參皂苷Rb1的提取物：復合酶＝1:0.25的重量比加入實施例1所得復合酶溶液，采用高低溫循環箱設置為150±5℃、冷卻水箱設[0139]在步驟S1中，含有人參皂苷Rb1的提取物和復合酶的重量比調整為含有人參皂苷[0146]在步驟S1中，含有人參皂苷Rb1的提取物和磷酸鈉緩沖液的重量比調整為含有人[0147]在步驟S1中，含有人參皂苷Rb1的提取物和復合酶的重量比調整為含有人參皂苷[0155]在步驟S1中，含有人參皂苷Rb1的提取物和磷酸鈉緩沖液的重量比調整為含有人[0159]在步驟S1中，含有人參皂苷Rb1的提取物和磷酸鈉緩沖液的重量比調整為含有人[0162]本發明復合酶及其制備方法的兩種對比例，對比例1_6所述復合酶的組分及其用[0167]在步驟S1中，含有人參皂苷Rb1的提取物和磷酸鈉緩沖液的重量比調整為含有人[0168]在步驟S1中，含有人參皂苷Rb1的提取物和復合酶的重量比調整為含有人參皂苷[0174]按照實施例5的方法采用實施例2_4、對比例1_7所得復合酶制劑以制備得到人參[0178]待測樣品的人參皂苷CK含量≥10％的人參皂苷CK固體粉末試樣稱取0.2_0.5g(精應對樣品進行適當稀釋并選擇合適的標準曲線范04016.504016.5夠高效利用人參皂苷Rb1使其轉化人參皂苷CK，所制備得到的產物中人參皂苷CK的含量達[0191]采用實施例2所得復合酶按照實施例5的方法對3批次含有人參皂苷Rb1的提取物[0194]如表8所示，不同批次證實本發明的復合酶及高效轉化高純度人參皂苷CK的方法[0196]采用實施例2所得復合酶制劑分別按照實施例5_9、對比例8的方法以制備得到人苷CK(命名為