枸杞干果中5種有機酸的測定 液相色譜-串聯質譜法

枸杞干果中5種有機酸的測定液相色譜-串聯質譜法1范圍本規程規定了采用液相色譜-串聯質譜法測定枸杞干果中5種有機酸（檸檬酸、蘋果酸、草酸、琥珀酸、酒石酸）含量的術語和定義、原理、試劑與材料、儀器設備、樣品處理、色譜-質譜條件、測定步驟、結果計算、精密度、準確度及注意事項。本規程適用于各類枸杞干果中上述5種有機酸的定量測定，檢出限、定量限滿足痕量檢測需求，其他漿果類干果可參照執行。枸杞干果需符合GB/T18672-2002《枸杞(枸杞子)》相關要求，確保樣品無霉變、無二氧化硫超標等問題。2術語和定義有機酸：本規程特指枸杞干果中天然存在的檸檬酸、蘋果酸、草酸、琥珀酸、酒石酸，均為水溶性有機酸，具有特定的化學結構和質譜裂解特征，是枸杞風味和營養價值的重要組成部分。液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）：將高效液相色譜的高效分離能力與串聯質譜的高靈敏度、高選擇性檢測能力相結合，通過液相色譜實現樣品中目標組分與基質雜質的分離，再經串聯質譜進行離子化、裂解，根據特征母離子和子離子進行定性，外標法峰面積定量的分析方法。母離子：目標化合物分子在離子源中失去或獲得電子形成的分子離子峰，具有特定的質荷比（m/z），是串聯質譜定性的基礎。子離子：母離子在碰撞室中與碰撞氣體發生裂解反應后產生的碎片離子，具有特征性的質荷比，用于進一步確認目標化合物，提高檢測的準確性和選擇性。回收率：樣品中添加已知量的5種有機酸標準物質后，經前處理和檢測，實際測得的標準物質含量與添加量的比值，用于評價方法的準確度。精密度：在相同實驗條件下，對同一均勻樣品進行多次重復檢測，測定結果的離散程度，通常用相對標準偏差（RSD）表示。3原理枸杞干果中的檸檬酸、蘋果酸、草酸、琥珀酸、酒石酸經超純水提取、超聲輔助溶解后，通過離心、濾膜過濾去除樣品中的大分子雜質、色素及不溶性顆粒物，實現樣品凈化。采用高效液相色譜法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠或親水作用色譜柱為固定相，適宜的緩沖液-有機相為流動相，對凈化后的提取液進行洗脫分離，使5種有機酸與樣品基質中的干擾組分有效分離。分離后的目標組分進入串聯質譜儀，采用電噴霧負離子源（ESI?）電離，選擇反應監測模式（SRM）進行檢測，根據各有機酸的特征母離子、子離子及保留時間進行定性確認；以標準系列溶液的峰面積對濃度繪制標準曲線，采用外標法計算樣品中5種有機酸的含量。該方法可有效規避基質干擾，提高檢測靈敏度和準確性，滿足痕量水平的定量要求。4試劑與材料4.1試劑除非另有說明，所用試劑均為分析純，實驗用水為超純水（電導率≤18.2μS/cm，25℃）；流動相所用有機相為色譜純，緩沖鹽試劑為優級純。檸檬酸標準品（純度≥99.5%）：編號、批號清晰，置于干燥密封容器中常溫保存。蘋果酸標準品（純度≥99.5%）：編號、批號清晰，置于干燥密封容器中常溫保存。草酸標準品（純度≥99.5%）：編號、批號清晰，置于干燥密封容器中常溫保存。琥珀酸標準品（純度≥99.5%）：編號、批號清晰，置于干燥密封容器中常溫保存。酒石酸標準品（純度≥99.5%）：編號、批號清晰，置于干燥密封容器中常溫保存。甲醇（CH?OH）：色譜純，用于配制流動相和標準溶液。乙腈（CH?CN）：色譜純，用于配制流動相，改善分離效果。甲酸（HCOOH）：優級純，用于調節流動相pH值，優化離子化效率。乙酸銨（CH?COONH?）：優級純，用于配制流動相緩沖液，提高分離選擇性。氨水（NH?·H?O）：優級純，濃度25%～28%，用于調節樣品提取液pH值（如需）。4.2試劑配制甲酸溶液（0.1%，v/v）：量取1mL甲酸，緩慢加入999mL超純水中，攪拌均勻，經0.22μm有機相濾膜過濾后備用，用于流動相配制和標準溶液稀釋。乙酸銨緩沖液（10mmol/L）：稱取0.7708g乙酸銨，加適量超純水溶解，冷卻后定容至1000mL，攪拌均勻，用甲酸微調pH至3.0～3.5，經0.22μm有機相濾膜過濾后備用。混合標準儲備液：分別精密稱取檸檬酸、蘋果酸、草酸、琥珀酸、酒石酸標準品各10.0mg，置于同一個100mL容量瓶中，加少量超純水溶解，用0.1%甲酸溶液定容至刻度，搖勻，得到濃度為100μg/mL的5種有機酸混合標準儲備液，4℃冷藏保存，有效期1個月，避免微生物污染。混合標準工作液：精密量取混合標準儲備液適量，用0.1%甲酸溶液逐級稀釋，配制濃度為0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL的混合標準工作液，現配現用，避免長時間放置導致濃度偏差。流動相：甲醇-10mmol/L乙酸銨緩沖液（10:90，v/v），或乙腈-0.1%甲酸溶液（8:92，v/v），根據色譜分離效果可適當調整比例，使用前超聲脫氣15min（功率200W，頻率40kHz），去除氣泡避免影響檢測。4.3材料濾膜：0.22μm、0.45μm有機相濾膜，用于流動相、標準溶液和樣品提取液過濾，去除微小雜質。離心管：50mL、10mL，聚四氟乙烯材質，耐酸耐堿，適合高速冷凍離心。容量瓶：10mL、50mL、100mL，玻璃材質，精度符合A級要求，用于標準溶液和樣品提取液定容。樣品瓶：2mL棕色樣品瓶，帶聚四氟乙烯墊片，用于儲存樣品提取液和標準工作液，避免光照影響。移液管：1mL、2mL、5mL、10mL，精度符合A級要求，用于試劑和標準溶液移取。離心管墊：耐高溫、耐腐蝕性材質，用于離心管密封，防止離心過程中液體滲漏。5儀器設備液相色譜-串聯質譜儀：配備電噴霧離子源（ESI），具備高壓輸液系統、柱溫箱、自動進樣器、串聯質譜檢測器，性能穩定，能實現選擇反應監測模式（SRM）檢測，符合相關儀器檢定規程要求。分析天平：精度0.1mg和0.001g，用于樣品和標準品稱量，定期校準確保精度。高速冷凍離心機：轉速≥10000r/min，溫度可調節（0～4℃），用于樣品提取液離心凈化，去除不溶性雜質。超聲波清洗器：功率≥200W，頻率40kHz，溫度可調節，用于樣品提取輔助溶解，避免高溫破壞目標組分。pH計：精度±0.01，用于調節試劑和樣品提取液的pH值，定期校準。粉碎機：用于枸杞干果粉碎，粉碎后過40目篩，確保樣品均勻，避免交叉污染。烘箱：控溫精度±1℃，溫度范圍30～100℃，用于樣品干燥（如需），去除多余水分。超純水機：能制備電導率≤18.2μS/cm（25℃）的超純水，滿足實驗用水需求。超聲脫氣機：用于流動相脫氣，去除氣泡，避免影響色譜分離效果和檢測靈敏度。渦旋振蕩器：轉速可調節，用于樣品提取液和標準溶液的搖勻，確保混合均勻。6樣品處理6.1樣品制備取枸杞干果樣品，去除雜質、破損顆粒及霉變個體，置于烘箱中60℃干燥至恒重（若樣品水分含量≤12%，可直接粉碎），冷卻至室溫后，用粉碎機粉碎，過40目篩，充分混勻，置于干燥密封容器中保存，避免吸潮和污染，備用。制備好的樣品應在24h內完成前處理，避免有機酸降解。6.2樣品提取精密稱取制備好的枸杞干果粉末2.000g，置于50mL離心管中，加入25mL超純水，渦旋振蕩5min，使樣品充分分散；置于超聲波清洗器中，30℃、200W、40kHz超聲提取20min，期間每隔5min渦旋振蕩1次，確保提取充分，避免局部提取不徹底。超聲提取完成后，取出冷卻至室溫，用超純水補足至25mL（彌補超聲過程中揮發的水分），渦旋搖勻，靜置10min。6.3樣品凈化將上述靜置后的樣品溶液轉移至高速冷凍離心機中，10000r/min、4℃離心15min，取上清液，經0.45μm有機相濾膜過濾，棄去初濾液（約1mL），取續濾液；將續濾液經0.22μm有機相濾膜再次過濾，去除微小雜質和膠體顆粒物，避免堵塞色譜柱和污染質譜檢測器。過濾后的續濾液置于2mL棕色樣品瓶中，避光保存，待LC-MS/MS檢測。若樣品基質干擾較大（色素、多糖含量較高），可在離心后取上清液，用0.1%甲酸溶液適當稀釋后再過濾檢測。7色譜-質譜條件7.1色譜條件色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱（HypersilODS2,250mm×4.6mm，5μm），或親水作用色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），或其他等效色譜柱，確保5種有機酸實現有效分離，分離度≥1.5。流動相：甲醇-10mmol/L乙酸銨緩沖液（10:90，v/v）；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10μL；洗脫方式：等度洗脫，洗脫時間20min，可根據分離效果適當調整洗脫時間。備注：若5種有機酸分離效果不佳，可調整流動相比例為乙腈-0.1%甲酸溶液（8:92，v/v），或采用梯度洗脫模式，優化分離條件。7.2質譜條件離子源：電噴霧負離子源（ESI?）；電離電壓：-4500V；離子源溫度：350℃；霧化氣壓力：0.35MPa；干燥氣流量：10L/min；碰撞氣：氮氣（純度≥99.999%）；檢測模式：選擇反應監測模式（SRM）。5種有機酸的特征母離子、子離子及碰撞能量（參考值）見表1，可根據儀器性能適當優化碰撞能量、駐留時間等參數，確保檢測靈敏度和定性準確性。序號有機酸名稱母離子（m/z）子離子（m/z）碰撞能量（eV）保留時間（min，參考值）1草酸8945153.22酒石酸14989184.53蘋果酸13389165.84琥珀酸11773147.35檸檬酸191111208.9注：表中保留時間和碰撞能量為參考值，實際檢測時需根據儀器型號、色譜柱性能進行優化校準。8測定步驟8.1儀器校準與調試開啟液相色譜-串聯質譜儀，按照儀器操作規程進行預熱（預熱時間≥30min），調試儀器各項參數（流動相流速、柱溫、離子源溫度、電離電壓等），直至儀器運行穩定，基線平穩（基線噪聲≤0.01mV），滿足檢測要求。8.2標準曲線繪制將配制好的系列濃度混合標準工作液（0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL），按濃度由低到高的順序依次進樣，按照上述色譜-質譜條件進行檢測，記錄每種有機酸的峰面積。以各有機酸的濃度（μg/mL）為橫坐標（x），對應的峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線，計算回歸方程和相關系數（r）。要求相關系數r≥0.999，否則需重新配制標準工作液，重新繪制標準曲線。8.3樣品測定將凈化后的樣品提取液，按照上述色譜-質譜條件進行進樣檢測，記錄每種有機酸的峰面積。若樣品提取液中某有機酸的峰面積超出標準曲線的線性范圍，需用0.1%甲酸溶液適當稀釋后再進樣檢測，稀釋倍數需準確記錄，用于后續結果計算。8.4空白實驗除不加入枸杞干果樣品外，其余操作均按照6.2、6.3節樣品處理步驟和8.3節測定步驟進行空白實驗，記錄空白溶液中5種有機酸的峰面積。若空白溶液中出現目標組分的峰，需排查試劑、實驗器具、環境等干擾因素，重新進行實驗。8.5平行實驗對同一枸杞干果樣品，平行制備3份樣品提取液，分別進行檢測，記錄每種有機酸的峰面積，計算平行測定結果的相對標準偏差（RSD），用于評價方法的精密度。8.6回收率實驗取已知含量的枸杞干果樣品，精密稱取3份，分別加入適量的混合標準儲備液，使添加濃度分別為低、中、高三個水平（低水平：0.5μg/g，中水平：5.0μg/g，高水平：10.0μg/g），按照6.2、6.3節樣品處理步驟和8.3節測定步驟進行檢測，計算回收率，評價方法的準確度。9結果計算與表示9.1結果計算根據樣品提取液中各有機酸的峰面積，代入對應有機酸的標準曲線回歸方程，計算樣品提取液中該有機酸的濃度（μg/mL），再按下列公式計算枸杞干果中該有機酸的含量：X=式中：X——樣品中某有機酸的含量，單位為毫克每100克（mg/100g）；C——由標準曲線計算得到的樣品提取液中該有機酸的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；C?——空白溶液中該有機酸的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；V——樣品提取液的定容體積，單位為毫升（mL）；f——樣品提取液的稀釋倍數（未稀釋時f=1）；m——稱取樣品的質量，單位為克（g）；1000——單位換算系數（1mg=1000μg）。平行測定3份樣品，計算測定結果的平均值，作為樣品中該有機酸的最終含量，計算結果保留兩位小數。9.2結果表示樣品中5種有機酸的含量分別以測定平均值表示，若某有機酸的測定值低于方法檢出限，則表示為“未檢出（ND）”，并注明該有機酸的檢出限。10精密度與準確度10.1精密度同一枸杞干果樣品平行測定6次，5種有機酸測定結果的相對標準偏差（RSD）應≤5.0%，否則需排查實驗操作、儀器狀態等因素，重新進行測定。10.2準確度低、中、高三個添加水平的回收率應在85.0%～115.0%之間，相對標準偏差（RSD）≤6.0%，確保方法的準確度滿足檢測要求。11檢出限與定量限本方法中5種有機酸的檢出限（LOD）為0.01μg/g～0.05μg/g，定量限（LOQ）為0.03μg/g～0.15μg/g，具體檢出限和定量限可根據儀器性能、樣品基質進行校準。當樣品中某有機酸的測定值≥定量限時，可準確定量；當測定值在檢出限～定量限之間時，需注明“檢出但未定量”；當測定值＜檢出限時，表示為“未檢出（ND）”。12注意事項標準品應妥善保存，混合標準儲備液4℃冷藏有效期為1個月，混合標準工作液現配現用，避免長時間放置導致濃度偏差；草酸標準品易吸潮，稱量時應快速操作，避免吸潮影響稱量精度。實驗所用器具（離心管、容量瓶、樣品瓶等）需用超純水反復清洗3次以上，晾干后使用，避免殘留雜質干擾檢測結果；色譜