烏天麻萌發菌菌種生產技術規程

烏天麻萌發菌菌種生產技術規程1范圍本規程規定了烏天麻萌發菌菌種生產過程中的術語定義、生產總則、生產環境與設施、培養基制備、菌種分離與純化、菌種擴大培養、菌種質量檢驗、菌種包裝、儲存與運輸、生產臺賬與追溯、監督管理及附則等全流程技術要求，明確操作標準與安全注意事項。本規程適用于各類烏天麻萌發菌菌種生產主體（企業、專業合作社、科研機構）的人工菌種生產，涵蓋母種、原種、栽培種三個等級的生產過程，兼顧科學性、實用性與規范性，作為烏天麻萌發菌菌種標準化生產、質量管控的依據，與《天麻種植農業投入品使用規范》《天麻固定菌床栽培技術規程》配套執行。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。《中華人民共和國農產品質量安全法》《中華人民共和國農藥管理條例》《中華人民共和國肥料登記管理辦法》《農產品質量安全農藥使用規范》（NY/T393-2020）《農產品質量安全肥料使用規范》（NY/T394-2013）《藥用植物及制劑外經貿綠色行業標準》（WM/T2-2004）《天麻生產技術規程》（LY/T2584-2016）《食用菌菌種管理辦法》《食用菌菌種生產技術規程》（NY/T528-2010）3術語和定義3.1烏天麻萌發菌特指與烏天麻種籽共生，能促進烏天麻種籽萌發，形成原生球莖，并為原生球莖初期生長提供營養，且對烏天麻生長無危害、共生性強的有益真菌（主要為紫萁小菇、石斛小菇等），是烏天麻有性繁殖的核心菌種，其活性直接決定烏天麻種籽發芽率和幼苗成活率。3.2母種又稱一級種，是烏天麻萌發菌菌種的原始種源，通過野生菌株分離純化、人工選育或引進合格菌株獲得，純度高、活性強、無雜菌、無病蟲害，用于原種的擴大培養，是菌種生產的基礎。3.3原種又稱二級種，以母種為種源，接種到適宜的固體培養基上擴大培養而成，菌絲濃密、活力旺盛、無雜菌污染，用于栽培種的生產，起到菌種擴繁、保持菌種特性的作用。3.4栽培種又稱三級種，以原種為種源，接種到規模化生產的固體培養基上擴大培養而成，菌絲布滿培養基、活力穩定，直接用于烏天麻種籽拌種或播種，是生產上應用最廣泛的菌種等級。3.5菌種分離與純化從健康的烏天麻原生球莖、野生共生菌株或合格菌種中，通過組織分離、孢子分離等方法獲得萌發菌菌株，再經多次培養、篩選，去除雜菌和變異菌株，獲得純度高、性狀穩定的單一菌株的過程，是保證菌種質量的核心環節。3.6菌種擴大培養將純化后的母種，逐步接種到不同規格、不同配方的培養基上，在適宜的溫濕度、通風等條件下培養，使菌絲數量快速增加、活力保持穩定，實現菌種從母種到原種、再到栽培種的規模化擴繁過程，需嚴格控制污染，保持菌種優良性狀。3.7菌種活力指烏天麻萌發菌菌絲的生長速度、濃密程度、抗逆性及與烏天麻種籽共生萌發的能力，是衡量菌種質量的關鍵指標，活力強的菌種能快速促進烏天麻種籽萌發，提高幼苗成活率。4生產總則4.1核心原則遵循“品種純正、無菌操作、循序漸進、質效并重”的原則，優先選用適配烏天麻生長、共生性強的優良萌發菌菌株，嚴格執行無菌生產規范，杜絕雜菌污染；優先采用綠色、生態的生產材料和技術，嚴格按照《天麻種植農業投入品使用規范》選用培養基原料、消毒用品等投入品，杜絕禁限用物質使用，兼顧菌種產量與質量，保護生產區域生態環境。4.2責任要求菌種生產主體對烏天麻萌發菌菌種生產全流程負主體責任，嚴格按照本規程操作，建立菌種生產技術臺賬，如實記錄菌株來源、培養基制備、菌種分離、擴繁、檢驗、包裝、儲存、運輸等相關信息，接受監管部門和社會監督，確保菌種質量可追溯。生產操作人員需經專業培訓，熟練掌握烏天麻萌發菌菌種分離、純化、擴繁、無菌操作、質量檢驗等核心技術，了解投入品規范使用要求，持證上崗，避免違規操作導致菌種污染、活力下降或性狀變異。監管部門、行業協會應加強對菌種生產技術的指導和監督，普及標準化生產知識，定期開展菌種質量抽查，查處違法違規生產、銷售不合格菌種的行為，規范菌種生產市場秩序。4.3基本要求菌種生產全過程使用的菌株、培養基原料、消毒用品、包裝材料等，需符合國家相關標準和本規程、《天麻種植農業投入品使用規范》要求，具備相應資質證明，嚴禁使用無資質、過期、變質、污染的材料，確保菌種生產安全。菌種分離、純化、擴繁、培養等操作需在無菌環境下進行，嚴格控制生產環境的溫濕度、通風、光照等條件，避免雜菌污染和菌種性狀變異；生產區域需與生活區域、其他微生物生產區域嚴格分離，防止交叉污染。建立菌種質量檢驗體系，對母種、原種、栽培種進行全程質量檢驗，不合格菌種嚴禁出廠、銷售和使用；建立菌種召回機制，對已出廠的不合格菌種，及時召回并妥善處置，防止危害烏天麻生產。5生產環境與設施5.1生產區域選址菌種生產場地需選擇地勢平緩、通風透氣、排水良好、環境整潔的區域，遠離工業污染、生活垃圾污染、水源污染區域，距離公路、工廠、養殖場等污染源不少于500米，避免粉塵、污水、有害氣體等污染。生產場地需遠離其他食用菌菌種生產場地、農作物種植區域，防止不同菌種交叉污染；場地周邊無雜草叢生、無腐爛雜物堆積，減少雜菌滋生源頭。5.2生產設施布局生產設施需按照“無菌操作、流程順暢、分區明確、防止污染”的原則布局，劃分以下功能區域，各區域獨立設置，避免交叉污染：菌株分離與純化室：用于烏天麻萌發菌菌株的分離、純化、復壯，配備無菌操作臺、培養箱、顯微鏡等設備，保持高度無菌環境。培養基制備室：用于母種、原種、栽培種培養基的配制、分裝、滅菌，配備攪拌機、分裝器、高壓蒸汽滅菌鍋等設備，地面需防水、防滑、易清潔。菌種培養室：用于母種、原種、栽培種的培養，配備恒溫培養箱、培養架、控溫、控濕、通風設備，確保培養環境穩定，可根據菌種等級劃分不同培養區域。質量檢驗室：用于菌種質量檢驗，配備顯微鏡、培養箱、無菌操作臺、天平、滅菌設備等，用于菌種純度、活力、雜菌檢測等。包裝與儲存室：用于菌種的包裝、臨時儲存，包裝區域需潔凈、無菌，儲存區域需干燥、通風、陰涼、避光，配備控溫、防潮、防蟲設備。廢棄物處理區：用于生產過程中產生的廢棄培養基、污染菌種、廢棄包裝材料等的集中存放和處置，遠離生產區域，防止污染環境和菌種。5.3生產設施要求5.3.1無菌設施分離純化室、培養基分裝區域、菌種接種區域需配備無菌操作臺（垂直流或水平流），無菌操作臺需定期消毒、檢測，確保無菌效果；室內需安裝紫外線消毒燈、空氣凈化器，定期對空氣進行消毒。無菌區域的門窗需密封良好，采用防塵、防菌材質，進入無菌區域需更換專用工作服、工作鞋、帽子、口罩，洗手消毒后進入，嚴禁非操作人員進入。5.3.2培養設施母種培養采用恒溫培養箱，溫度可調節范圍為15-30℃，精度±1℃，具備控溫、保濕、通風功能，定期校準溫度，確保培養溫度穩定。原種、栽培種培養采用培養架，培養架高度適宜，便于操作和通風；培養室配備控溫設備（暖氣、空調、加熱管等）、控濕設備（加濕器、除濕機等）、通風設備（排風扇、通風管道等），溫度可控制在20-25℃，相對濕度控制在60%-70%，通風良好，無直射光照。5.3.3滅菌設施培養基、接種工具、包裝材料等滅菌采用高壓蒸汽滅菌鍋，壓力可調節范圍為0.10-0.15MPa，溫度可調節范圍為121-126℃，具備自動控壓、控溫、計時功能，容積適配生產規模，定期檢修、校準，確保滅菌效果。小型接種工具（接種針、接種環、鑷子等）可采用干熱滅菌箱滅菌，溫度控制在160-180℃，滅菌時間不少于2小時；無菌區域空氣消毒采用紫外線消毒燈，波長254nm，功率不低于30W，每10平方米至少安裝1盞，消毒時間不少于30分鐘。5.3.4檢驗與其他設施質量檢驗室配備顯微鏡（放大倍數不低于1000倍）、恒溫培養箱、無菌操作臺、電子天平（精度0.01g）、pH計、滅菌鍋等設備，用于菌種純度檢測、菌絲活力觀察、雜菌鑒定等。包裝區域配備包裝機、電子秤、封口機等設備，包裝材料需符合無菌、無毒、透氣、防潮要求；儲存室配備貨架、控溫設備（溫度可控制在0-10℃）、防潮設備（除濕機）、防蟲設備（防蟲網、粘蟲板），避免菌種受潮、霉變、蟲蛀。5.4環境消毒與維護生產區域每天進行清潔，清除雜物、灰塵，地面、墻面、設備表面定期用低毒、無殘留的消毒用品（如75%酒精、多菌靈溶液等）擦拭消毒；無菌區域每周進行一次徹底消毒，消毒后通風30分鐘以上，方可進行操作。生產設施（無菌操作臺、培養箱、滅菌鍋、接種工具等）定期進行清潔、消毒、檢修，無菌操作臺每次使用前消毒30分鐘，使用后及時清潔；滅菌鍋每次使用后清理鍋內水垢，定期進行壓力、溫度校準。生產區域周邊定期清理雜草、腐爛雜物，噴灑消毒用品，減少雜菌滋生；廢棄物處理區的廢棄材料及時清運、消毒，嚴禁隨意堆放，防止污染環境和生產區域。6培養基制備6.1培養基制備原則培養基制備需遵循“營養均衡、適配萌發菌生長、無菌無毒、成本合理”的原則，根據烏天麻萌發菌的營養需求，選擇適宜的原料，合理搭配配方，確保培養基營養充足，能促進菌絲快速生長、保持菌種活力；制備過程嚴格執行無菌操作，避免雜菌污染。6.2原料選擇與要求碳源原料：選用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、闊葉樹鋸末（青岡、板栗、樺樹等）、玉米芯（粉碎）、麥麩、米糠等，要求干凈、無雜菌、無病蟲害、無霉變、無異味，其中鋸末需提前晾曬5-7天，消毒殺菌，去除揮發性物質。氮源原料：選用蛋白胨、酵母膏、黃豆粉（粉碎）、花生餅粉、尿素等，要求純度高、無雜菌、無霉變，其中黃豆粉、花生餅粉需提前粉碎、晾曬，消毒殺菌，避免帶入雜菌。礦物質原料：選用磷酸二氫鉀、硫酸鎂、碳酸鈣、石膏等，要求純度高、無雜質、無霉變，用于補充培養基中的礦物質元素，調節培養基pH值，促進菌絲生長。其他原料：瓊脂（用于母種固體培養基），要求凝固性好、無雜菌、無霉變；消毒用品（多菌靈、高錳酸鉀、75%酒精等），符合《天麻種植農業投入品使用規范》要求，低毒、無殘留。水源：選用清潔、無污染的自來水、井水或蒸餾水，pH值在5.5-7.0，避免使用污水、含重金屬的水。6.3培養基配方（適宜烏天麻萌發菌）6.3.1母種培養基（固體）配方1（常用）：葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母膏5g、瓊脂20g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂1g、蒸餾水1000mL，pH值5.8-6.2。配方2（備用）：蔗糖20g、黃豆粉15g、瓊脂20g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂1g、碳酸鈣3g、蒸餾水1000mL，pH值5.8-6.2。6.3.2原種培養基（固體）配方1（常用）：闊葉樹鋸末70%、麥麩20%、蔗糖2%、黃豆粉5%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸鎂0.1%、石膏1.7%、水適量，含水量60%-65%（手握成團、松開即散），pH值5.8-6.2。配方2（備用）：玉米芯（粉碎）60%、米糠25%、麥麩10%、蔗糖2%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸鎂0.1%、石膏2.7%、水適量，含水量60%-65%，pH值5.8-6.2。6.3.3栽培種培養基（固體）配方1（常用）：闊葉樹鋸末75%、麥麩15%、蔗糖1%、黃豆粉6%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.1%、石膏2.8%、水適量，含水量60%-65%，pH值5.8-6.2。配方2（備用）：玉米芯（粉碎）65%、麥麩20%、米糠8%、蔗糖1%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.1%、石膏5.8%、水適量，含水量60%-65%，pH值5.8-6.2。6.4培養基制備步驟6.4.1母種培養基制備配料：按照配方比例，準確稱量各原料，將葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氫鉀、硫酸鎂等可溶性原料溶于適量蒸餾水中，攪拌均勻，確保完全溶解；瓊脂單獨放入另一容器中，加入剩余蒸餾水，浸泡30分鐘，使其充分軟化。融膠：將浸泡軟化的瓊脂置于酒精燈或電磁爐上加熱，不斷攪拌，直至瓊脂完全融化，避免局部過熱燒焦；然后將溶解好的可溶性原料溶液倒入瓊脂溶液中，攪拌均勻，補充蒸餾水至1000mL。調pH值：用pH計檢測培養基pH值，若pH值偏高，用鹽酸溶液調節；若偏低，用氫氧化鈉溶液調節，直至pH值達到5.8-6.2。分裝：將配制好的培養基趁熱分裝到試管中，分裝量為試管容積的1/5-1/4，分裝過程中避免培養基沾到試管口和管壁，防止污染；分裝后，及時塞緊試管塞（硅膠塞或棉塞），棉塞需松緊適度，既能透氣，又能防止雜菌進入。滅菌：將分裝好的試管放入高壓蒸汽滅菌鍋中，壓力調至0.11-0.12MPa，溫度121℃，滅菌20分鐘；滅菌結束后，緩慢排氣，待鍋內壓力降至常壓后，打開鍋蓋，取出試管。擺斜面：將取出的試管趁熱擺成斜面，斜面長度為試管長度的1/2-2/3，放置在潔凈、平整的桌面上，自然冷卻至凝固，凝固后即為母種斜面培養基；冷卻后，放入恒溫培養箱中，30℃培養24小時，檢查無雜菌污染后，備用。6.4.2原種、栽培種培養基制備配料：按照配方比例，準確稱量各原料，將鋸末、麥麩、玉米芯、黃豆粉等固體原料放入攪拌機中，攪拌均勻；將蔗糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂等可溶性原料溶于適量水中，攪拌均勻，倒入固體原料中，邊倒邊攪拌，確保原料混合均勻。調含水量與pH值：加入適量水，不斷攪拌，調節培養基含水量至60%-65%（手握成團、松開即散，指縫間有少量水珠滲出，不滴水）；用pH計檢測pH值，調節至5.8-6.2，若pH值偏高，加入少量鹽酸溶液；若偏低，加入少量碳酸鈣調節。堆積發酵（可選）：將配制好的培養基堆積成高30-40cm、寬50-60cm的堆，蓋上塑料薄膜，自然發酵2-3天，每天翻堆1次，調節溫度至25-30℃，促進原料腐熟，殺滅部分雜菌；發酵結束后，攤開晾曬1-2小時，冷卻至室溫。分裝：將冷卻后的培養基分裝到培養瓶（玻璃瓶或聚丙烯瓶）或菌袋中，分裝量為培養瓶（菌袋）容積的2/3，分裝過程中避免培養基沾到瓶口（袋口），分裝后，輕輕壓實，使培養基質地均勻、疏松透氣。封口：培養瓶用硅膠塞或棉塞封口，棉塞需包裹一層紗布，防止雜菌進入；菌袋用封口機封口，或用繩子扎緊，封口處需平整、嚴密，確保無菌。滅菌：將分裝好的培養瓶（菌袋）放入高壓蒸汽滅菌鍋中，原種培養基滅菌壓力0.12-0.13MPa，溫度121-123℃，滅菌30分鐘；栽培種培養基滅菌壓力0.11-0.12MPa，溫度121℃，滅菌25-30分鐘；滅菌結束后，緩慢排氣，待鍋內壓力降至常壓后，打開鍋蓋，取出培養瓶（菌袋），放置在潔凈、通風的地方，自然冷卻至室溫，備用。無菌檢查：冷卻后的培養基，放入恒溫培養箱中，25℃培養24-48小時，檢查無雜菌污染（培養基表面無霉菌、細菌生長，無異味）后，方可用于接種。6.5培養基制備注意事項原料稱量需準確，尤其是營養物質和礦物質原料，避免比例失衡影響菌絲生長；可溶性原料需充分溶解，避免結塊，影響培養基營養均勻性。瓊脂加熱融膠時，需不斷攪拌，避免局部過熱燒焦，影響培養基凝固性；培養基分裝需趁熱進行，避免瓊脂凝固，無法分裝。滅菌過程中，嚴格控制壓力、溫度和時間，確保滅菌徹底；滅菌結束后，緩慢排氣，避免試管、培養瓶（菌袋）因壓力驟變破裂。冷卻后的培養基需及時進行無菌檢查，發現雜菌污染的，立即丟棄，嚴禁使用；培養基存放時間不宜過長，母種培養基存放不超過7天，原種、栽培種培養基存放不超過3天，避免雜菌污染和營養流失。7菌種分離與純化7.1分離材料選擇優先選擇健康、無病蟲害、共生性強的烏天麻原生球莖（播種后1-2個月，直徑0.5-1cm，色澤潔白、飽滿）作為分離材料，原生球莖需來自正規烏天麻繁育基地，確保菌株適配性。也可選擇野生烏天麻共生的萌發菌菌株（如紫萁小菇、石斛小菇），或引進的合格烏天麻萌發菌菌株，引進菌株需具備菌株質量檢驗合格證明、品種鑒定報告等資質。分離材料需新鮮，采集后及時進行分離操作，常溫下存放不超過24小時，存放時置于陰涼、通風、無菌處，避免霉變、污染。7.2分離方法（常用組織分離法）分離前準備：將分離材料、接種工具（接種針、鑷子、剪刀）、母種培養基試管、無菌操作臺等進行徹底消毒；操作人員更換專用工作服、工作鞋、帽子、口罩，洗手消毒后，進入無菌操作臺操作。材料消毒：將采集的烏天麻原生球莖用清水輕輕沖洗干凈，去除表面土壤、雜物，然后放入75%酒精溶液中浸泡30秒，消毒表面；再放入0.1%高錳酸鉀溶液中浸泡5-10分鐘，徹底消毒；最后用無菌蒸餾水沖洗3-4次，去除殘留的消毒藥液，用無菌濾紙吸干表面水分。組織切塊：在無菌操作臺下，用無菌剪刀、鑷子將消毒后的原生球莖切開，選取內部潔白、飽滿、無病斑、無損傷的組織塊，切成0.3-0.5cm的小塊，避免損傷組織細胞。接種培養：用無菌接種針將切好的組織塊接種到母種斜面培養基上，每個試管接種1-2塊組織塊，接種時避免組織塊沾到試管口和管壁，接種后，輕輕按壓組織塊，使其與培養基緊密接觸；接種完成后，塞緊試管塞，標記分離日期、材料來源、菌株名稱等信息，放入恒溫培養箱中，22-25℃恒溫培養，避光培養，避免光照影響菌絲生長。7.3菌種純化初次純化：組織塊接種培養3-5天后，觀察菌絲生長情況，當菌絲從組織塊上萌發，長出白色、纖細的菌絲時，及時挑選菌絲生長旺盛、無雜菌污染的試管，在無菌操作臺下，用無菌接種針挑取少量健壯的菌絲，接種到新的母種斜面培養基上，22-25℃恒溫培養，避光培養。二次純化：重復初次純化操作，將挑取的菌絲再次接種到新的母種斜面培養基上，培養3-5天，觀察菌絲生長情況，去除雜菌污染、菌絲細弱、生長緩慢的試管，保留菌絲潔白、濃密、生長旺盛、無雜菌的試管，直至獲得純度高、性狀穩定的單一菌株，即為母種原始菌株。純化檢查：純化后的母種，放入恒溫培養箱中，22-25℃培養7-10天，用顯微鏡觀察菌絲形態，確保菌絲形態一致、無雜菌（無細菌、霉菌等其他微生物），同時記錄菌絲生長速度、濃密程度等性狀，篩選出活力強、共生性好的母種菌株。7.4菌種復壯為保持烏天麻萌發菌菌種的優良性狀和活力，避免菌種退化，需定期對母種進行復壯，復壯周期不超過6個月，復壯方法如下：選取活力強、無雜菌、性狀穩定的母種菌株，接種到新的母種斜面培養基上，22-25℃恒溫培養7-10天，促進菌絲快速生長。將復壯后的母種菌株，接種到原種培養基上，擴大培養，獲得原種；也可再次通過組織分離法，從健康的烏天麻原生球莖中分離菌株，與現有母種菌株進行對比，篩選出優良菌株，實現復壯。7.5分離與純化注意事項分離與純化全過程需嚴格執行無菌操作，接種工具、培養基、分離材料等需徹底消毒，避免雜菌污染，確保獲得純凈的菌株。組織塊切割需精細，避免損傷組織細胞，影響菌絲萌發；接種時，組織塊與培養基需緊密接觸，促進菌絲快速生長。培養過程中，定期觀察菌絲生長情況，及時去除雜菌污染、菌絲退化的試管，避免雜菌擴散和菌種退化。純化后的母種，需單獨存放，標記清晰，避免與其他菌種混淆；復壯后的母種，需進行質量檢驗，合格后方可用于原種生產。8菌種擴大培養8.1擴大培養原則菌種擴大培養需遵循“循序漸進、無菌操作、保持性狀、控制污染”的原則，從母種到原種、再到栽培種，逐步擴大培養規模，嚴格控制培養條件，確保菌絲生長旺盛、活力穩定，保持烏天麻萌發菌的優良性狀，杜絕雜菌污染和菌種退化。8.2母種擴大培養（用于原種接種）接種前準備：選擇純度高、活力強、無雜菌、性狀穩定的母種菌株和合格的母種斜面培養基；將接種工具（接種針、鑷子）、無菌操作臺、培養箱等進行徹底消毒；操作人員做好無菌防護，進入無菌操作臺操作。接種：在無菌操作臺下，用無菌接種針挑取母種斜面上健壯的菌絲（帶少量培養基），接種到新的母種斜面培養基上，每個母種試管可接種3-5個新的試管，接種時避免菌絲斷裂，接種后，輕輕按壓菌絲，使其與培養基緊密接觸；接種完成后，塞緊試管塞，標記接種日期、母種編號、菌株名稱等信息。培養：將接種后的母種試管放入恒溫培養箱中，22-25℃恒溫培養，避光培養，培養期間，定期觀察菌絲生長情況，保持培養箱通風、濕度適宜（相對濕度60%-70%）；培養7-10天，當菌絲布滿培養基斜面，菌絲潔白、濃密、活力旺盛，無雜菌污染時，即為擴大培養后的母種，可用于原種接種。8.3原種擴大培養（用于栽培種接種）接種前準備：選擇合格的母種（擴大培養后的母種）和原種培養基（冷卻至室溫、無雜菌污染）；將接種工具、無菌操作臺、培養室等進行徹底消毒；操作人員做好無菌防護，進入無菌操作臺操作。接種：在無菌操作臺下，用無菌接種針挑取母種斜面上健壯的菌絲（帶少量培養基），接種到原種培養基中，每個母種試管可接種3-5個原種培養瓶（菌袋），接種量為原種培養基重量的5%-8%；接種時，將菌絲均勻分布在培養基表面，輕輕按壓，使其與培養基緊密接觸；接種完成后，及時封口，標記接種日期、母種編號、原種編號等信息。培養：將接種后的原種培養瓶（菌袋）放入培養室中，擺放整齊，保持培養室溫度22-25℃，相對濕度60%-70%，通風良好，避光培養；培養期間，定期觀察菌絲生長情況，每天通風1-2次，每次30分鐘，避免雜菌污染；培養15-20天，當菌絲布滿整個培養基，菌絲潔白、濃密、活力旺盛，無雜菌污染、無異味時，即為合格原種，可用于栽培種接種。8.4栽培種擴大培養（用于生產應用）接種前準備：選擇合格的原種和栽培種培養基（冷卻至室溫、無雜菌污染）；將接種工具、無菌操作臺、培養室等進行徹底消毒；操作人員做好無菌防護，進入無菌操作臺操作；規模化生產時，可采用接種機接種，提高接種效率，確保接種均勻。接種：在無菌操作臺下，用無菌接種針或接種鏟，挑取原種培養基中健壯的菌絲（帶少量培養基），接種到栽培種培養基中，每個原種培養瓶可接種10-15個栽培種培養瓶（菌袋），接種量為栽培種培養基重量的8%-10%；接種時，將菌絲均勻分布在培養基表面和內部，輕輕壓實，使其與培養基緊密接觸；接種完成后，及時封口，標記接種日期、原種編號、栽培種編號、生產批次等信息。培養：將接種后的栽培種培養瓶（菌袋）放入培養室中，擺放整齊，保持培養室溫度22-25℃，相對濕度60%-70%，通風良好，避光培養；培養期間，定期觀察菌絲生長情況，每天通風1-2次，每次30-60分鐘，及時清除雜菌污染的培養瓶（菌袋），避免雜菌擴散；培養20-25天，當菌絲布滿整個培養基，菌絲潔白、濃密、活力旺盛，無雜菌污染、無異味，觸摸有韌性時，即為合格栽培種，可用于烏天麻種籽拌種或播種。8.5擴大培養注意事項接種過程嚴格執行無菌操作，接種工具需徹底滅菌，接種時避免菌絲暴露在空氣中時間過長，防止雜菌污染和菌絲活力下降。培養過程中，嚴格控制溫濕度、通風、光照等條件，溫度過高（高于28℃）易導致菌絲老化、雜菌滋生；溫度過低（低于20℃）易導致菌絲生長緩慢；通風不良易導致雜菌污染，影響菌種質量。定期觀察菌絲生長情況，及時去除雜菌污染、菌絲細弱、生長緩慢的菌種，避免雜菌擴散和菌種退化；接種后，做好標記，便于追溯和管理。菌種擴大培養的代數不宜過多，母種擴大培養不超過3代，原種擴大培養不超過1代，栽培種直接用于生產，避免代數過多導致菌種退化，影響與烏天麻種籽的共生效果。9菌種質量檢驗9.1檢驗原則遵循“全程檢驗、嚴格標準、客觀公正、及時處置”的原則，對母種、原種、栽培種進行產前、產中、產后全程檢驗，檢驗項目、檢驗標準符合本規程要求，不合格菌種嚴禁出廠、銷售和使用，確保菌種質量達標，能滿足烏天麻種籽萌發需求。9.2檢驗項目與標準9.2.1母種質量檢驗純度檢驗：無雜菌污染，顯微鏡下觀察，菌絲形態一致，無細菌、霉菌、酵母菌等其他微生物；培養基表面無綠色、黑色、黃色等雜菌菌落，無異味。活力檢驗：菌絲潔白、纖細、濃密，生長旺盛，生長速度正常（22-25℃培養，每天生長0.5-1cm）；菌絲觸摸有韌性，無褐變、無萎縮、無腐爛。性狀檢驗：菌絲形態符合烏天麻萌發菌（如紫萁小菇、石斛小菇）的典型特征，無變異；與烏天麻種籽共生性強，接種到種籽上，能促進種籽快速萌發（萌發率不低于80%）。9.2.2原種質量檢驗純度檢驗：無雜菌污染，培養基表面和內部無雜菌菌落，無異味；顯微鏡下觀察，菌絲形態一致，無其他微生物。活力檢驗：菌絲潔白、濃密、健壯，生長均勻，布滿整個培養基；菌絲活力旺盛，觸摸有韌性，無褐變、無萎縮、無腐爛；22-25℃培養，15-20天內菌絲布滿培養基。性狀檢驗：菌絲形態穩定，符合烏天麻萌發菌的典型特征，無變異；接種到栽培種培養基上，能快速生長，菌絲蔓延速度正常。9.2.3栽培種質量檢驗純度檢驗：無雜菌污染，培養基表面和內部無雜菌菌落，無異味；顯微鏡下觀察，菌絲形態一致，無其他微生物；規模化生產時，抽樣檢驗，雜菌污染率不超過1%。活力檢驗：菌絲潔白、濃密、健壯，生長均勻，布滿整個培養基；菌絲活力旺盛，觸摸有韌性，無褐變、無萎縮、無腐爛；22-25℃培養，20-25天內菌絲布滿培養基。性狀檢驗：菌絲形態穩定，符合烏天麻萌發菌的典型特征，無變異；與烏天麻種籽共生性強，拌種后，種籽萌發率不低于75%，能促進原生球莖正常生長。外觀檢驗：培養瓶（菌袋）無破損、無泄漏，封口嚴密；培養基質地均勻、疏松透氣，含水量適宜（60%-65%），無結塊、無霉變。9.3檢驗方法9.3.1外觀檢驗肉眼觀察菌種的外觀、菌絲生長情況、培養基狀態，檢查有無雜菌菌落、異味、菌絲褐變、萎縮、腐爛等情況；檢查培養瓶（菌袋）有無破損、泄漏，封口是否嚴密。9.3.2顯微鏡檢驗取少量菌絲，置于顯微鏡下（放大倍數不低于1000倍），觀察菌絲形態、結構，檢查有無雜菌（細菌、霉菌等），判斷菌絲是否正常、有無變異。9.3.3培養檢驗選取少量菌種，接種到新的相應等級培養基上，22-25℃恒溫培養，觀察菌絲生長速度、濃密程度、活力情況，檢查有無雜菌污染，判斷菌種質量。9.3.4共生性檢驗取少量栽培種，與烏天麻種籽混合拌勻，播種到無菌腐殖土中，22-25℃恒溫、避光培養，觀察種籽萌發情況，計算萌發率，萌發率不低于75%即為合格，判斷菌種與烏天麻種籽的共生性。9.4檢驗批次與抽樣檢驗批次：以同一菌株、同一培養基配方、同一滅菌批次、同一培養條件生產的菌種為一個檢驗批次，每個批次單獨檢驗。抽樣方法：每個檢驗批次，隨機抽樣，母種每批次抽樣不少于5支，原種每批次抽樣不少于10瓶（袋），栽培種每批次抽樣不少于20瓶（袋），抽樣需具有代表性，抽樣后，及時標記抽樣批次、抽樣時間、抽樣數量等信息。9.5檢驗結果處理檢驗合格的菌種：出具菌種質量檢驗合格證明，標注菌種等級、菌株名稱、生產批次、檢驗日期、檢驗結果等信息，方可出廠、銷售和使用。檢驗不合格的菌種：立即隔離存放，標記不合格原因（雜菌污染、活力不足、性狀變異等），嚴禁出廠、銷售和使用；不合格菌種需及時妥善處置（高溫滅菌后深埋或焚燒），防止雜菌擴散和污染環境。檢驗記錄：做好菌種質量檢驗記錄，如實記錄檢驗批次、抽樣信息、檢驗項目、檢驗結果、不合格原因、處置情況等信息，留存備查，檢驗記錄留存期限不少于5年。10菌種包裝、儲存與運輸10.1菌種包裝10.1.1包裝材料要求母種包裝：采用無菌、透明的玻璃試管，試管口用硅膠塞或棉塞封口，棉塞需包裹一層紗布，外層用parafilm膜纏繞密封，防止雜菌進入和水分流失；試管外套上標簽，標注菌種等級、菌株名稱、母種編號、分離/接種日期、生產單位、保質期等信息。原種、栽培種包裝：采用無菌、透氣、防潮、不易破損的玻璃瓶或聚丙烯菌袋，瓶口（袋口）用硅膠塞、棉塞或封口機封口，封口嚴密；包裝容器外標注菌種等級、菌株名稱、生產批次、接種日期、保質期、生產單位、聯系方式等信息，標簽清晰、牢固，不易脫落。包裝材料需符合無菌、無毒、環保要求，無異味、無污染，嚴禁使用破損、污染、過期的包裝材料。10.1.2包裝操作要求包裝操作需在潔凈、無菌的環境中進行，操作人員做好無菌防護，避免包裝過程中雜菌污染菌種。包裝前，再次檢查菌種質量，確保菌種合格；包裝時，動作輕柔，避免損傷菌絲和包裝容器，確保封口嚴密，防止水分流失和雜菌進入。每個包裝容器內的菌種量需均勻，標注信息完整、清晰，便于識別和追溯；包裝完成后，將菌種整齊擺放，避免擠壓、碰撞。10.2菌種儲存10.2.1儲存條件母種儲存：儲存于溫度0-5℃、相對濕度50%-60%、干燥、通風、陰涼、避光的儲存室中，可放入冰箱冷藏儲存；儲存期間，保持溫度穩定，避免溫度波動過大，避免潮濕、光照和雜