(5.2.2)-5.2.2 常用檢測技術 (分子生物學技術)完

分子生物學技術01分子生物學的概念0203實時熒光定量PCR免疫共沉淀染色質免疫共沉淀技術04目錄分子生物學的概念第一章分子生物學（molecularbiology）是一門研究生物大分子的結構與功能的科學，旨在闡明生命現象的本質。它的發展與生物化學、生物物理學等其他學科相互交叉和滲透，形成了現代生命科學中的前沿領域。分子生物學的概念分子生物學的誕生可以追溯到1953年沃森和克里克提出DNA分子的雙螺旋結構模型。這一發現標志著分子生物學的誕生，并推動了其后的發展。隨著現代化學和物理學理論、技術和方法的應用，生物大分子的結構與功能研究取得了顯著進展，為分子生物學的蓬勃發展奠定了基礎。自20世紀50年代以來，分子生物學已經成為生物學的一個重要分支，其核心內容是通過研究生物物質基礎如核酸、蛋白質、酶等的結構、功能及其相互作用的規律，來揭示生命的奧秘。分子生物學的發展分子生物學技術與遺傳性疾病的研究、基因工程、PCR（聚合酶鏈反應）、單鏈構象多態性分析等領域密切相關，為生物學和醫學的各個領域提供了一個強有力的技術平臺，使得人們能夠從分子水平上檢測和比較不同物種、個體、細胞或生理（病理）狀態的差異。分子生物學技術的意義實時熒光定量PCR第二章PCR又稱為聚合酶鏈反應（PolymeraseChainReaction），是體外通過酶促反應合成特異DNA片段的一種方法。實時熒光定量PCR是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。目前，熒光定量PCR技術廣泛應用于醫學，如癌癥的診斷、病原體的感染以及基因缺陷性疾病的檢測。實時熒光定量PCR的概念DNA染料法熒光探針法猝滅染料引物法實時熒光定量PCR技術分類實時熒光定量PCR主要體現在熒光、實時與定量3個關鍵詞上。熒光是指在標準PCR體系中加入了熒光物質；實時是指通過熒光信號的積累能夠實時監測每次循環后PCR產物的變化，并生成熒光擴增曲線；定量是指該技術能夠實現對初始模板的定量分析。常用的兩種方法是SYBRgreen（熒光染料摻入法）和Taqmanprobe（探針法）。SYBRgreen（熒光染料摻入法）是在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。Taqmanprobe（探針法）是PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。梁子英,劉芳.實時熒光定量PCR技術及其應用研究進展[J].現代農業科技,2020(06):1-3+8.實時熒光定量PCR的實驗原理各組大鼠FNGABAA受體mRNA相對表達量比較模型組：大鼠GABAA受體mRNA表達升高（P＜0.01）；電針組：大鼠GABAA受體mRNA表達降低（P＜0.01）；與電針組比較，激動劑組、激動劑＋電針組大鼠GABAA受體mRNA表達升高（P＜0.01）王帥亞,舒琪,陳翩翩,等.電針預處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠小腦頂核GABAA受體及交感神經活動的影響[J].中國針灸神經示蹤技術第三章免疫共沉淀技術（Co-immunoprecipitation，Co-IP）是目前廣泛應用的一種研究體內蛋白質與蛋白質相互作用的方法，具有靈敏性高、特異性強、可信度高、自然狀態下可操作且能夠對蛋白半定量分析等優點。免疫共沉淀的概念信號傳導、基因調控中相互作用因子的發現；血清中和抗體的快速篩選；受體蛋白結合配體的發現；病毒蛋白、激素、信號分子膜上結合位點的發現；核酸序列轉錄因子的發現；中草藥活性成分的分離鑒定；中草藥藥效靶點的發現與確認等方面。免疫共沉淀的應用在細胞裂解液中加入抗目的蛋白的抗體，孵育后再加入與抗體特異結合的結合于sepharosebeads上的proteinA/G，細胞中有目的蛋白結合，就形成一種復合物-目的蛋白/目的蛋白-抗目的蛋白抗體-proteinA/G，經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，復合物被分開。最后經免疫印跡或質譜對目的蛋白進行分析。免疫共沉淀的實驗原理易璇,陳麗,王靜芝,等.電針對胰島素抵抗大鼠肝臟組織SIRT1/ATG7信號通路的影響[J].華中科技大學學報(醫學版),2023,52(02):212-217.各組大鼠肝臟ATG7蛋白乙酰化水平比較染色質免疫共沉淀技術第四章染色質免疫共沉淀技術（chromatinimmunoprecipitationassay，ChIP）是目前被廣泛應用于研究DNA和蛋白質相互作用的方法。同時，結合生物信息學的方法也可以預測DNA中轉錄因子結合位點的保守序列。ChIP技術能夠在體內研究轉錄因子和靶基因啟動子區域直接的相互作用，可以直接確定它們之間相互作用的動態變化，得到轉錄因子結合位點的信息，確定其直接作用的靶基因序列。ChIP技術被廣泛應用于體內轉錄調節因子與靶基因啟動子結合方面的研究，并成為染色質水平研究基因表達調控的有效方法。許昆,張靜,楊敬平,等.脂肪組分染色質免疫共沉淀研究方法的建立[J].腎臟病與透析腎移植雜志,2022,31(02):144-148.染色質免疫共沉淀技術的概念應用于表觀遺傳信息研究。這項技術幫助研究者判斷在細胞核中基因組的某一特定位置會出現何種組蛋白修飾；檢測體內反式因子與DNA的動態作用，研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系；深入分析癌癥、心血管疾病以及中央神經系統紊亂等疾病的主要代謝通路的一種非常有效的工具；廣泛應用于體內轉錄調節因子與靶基因啟動子結合方面的研究，并成為染色質水平研究基因表達調控的有效方法。染色質免疫共沉淀技術的應用染色質免疫共沉淀技術相互作用的蛋白質都是經翻譯后修飾的，處于天然狀態；蛋白的相互作用是在自然狀態下進行的，可以避免人為的影響；可以分離得到天然狀態的相互作用蛋白復合物。但是該技術可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質－蛋白質相互作用；兩種蛋白質的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預測不正確，實驗就得不到結果，方法本身具有冒險性；靈敏度沒有親和色譜高。染色質免疫共沉淀技術的應用交聯免疫共沉淀(cross-linkedChIP,X-ChIP)。X-ChIP一般采用甲醛作為可逆的交聯劑,通過超聲波將染色質破碎為200–500bp的片段;免疫沉淀后,將蛋白質-DNA復合體解交聯,蛋白質可通過蛋白酶進行降解,然后純化提取DNA。由于甲醛固定增強了DNA與蛋白質的結合程度,降低了蛋白質重排的可能性,因此X-ChIP的靈敏度較高,適用于轉錄因子等與DNA結合程度不是很強的蛋白質研究。無交聯免疫共沉淀(nativeChIP,N-ChIP)。N-ChIP是利用核酸酶消化未經固定的染色質,由于未經固定的蛋白質-DNA復合體保持在自然狀態,因此N-ChIP適用于與DNA結合緊密的組蛋白修飾的表觀遺傳學研究;同時,由于抗體與未固定的目標蛋白質結合程度高,因此N-ChIP的特異性較強,DNA富集效率高。王泓力,焦雨鈴.染色質免疫共沉淀實驗方法[J].植物學報,2020,55(04):475-480.染色質免疫共沉淀技術的分類在生理狀態下將細胞內DNA與蛋白質交聯在一起，通過超聲或酶處理方法，將染色質切為小片段，利用抗原抗體特異性識別反應，將與目的基因結合的蛋白質沉淀下來，再通過多種下游檢測技術（實時定量PCR、基因芯片等）檢測富集片段的DNA序列。染色質免疫共沉淀技術的實驗原理張雪,金美玉,于洋,等.小鼠生殖細胞特異性轉錄因子NOBOX調控初級卵泡發育機制的研究[J].中國比較醫學雜志,2021,31(04):107-114.a-c代表NOBOX可與Kit啟動子(-2933