PCR實(shí)驗(yàn)室知識(shí)及新冠檢測(cè)生物安全培訓(xùn)考試(試題與答案)

PCR實(shí)驗(yàn)室知識(shí)及新冠檢測(cè)生物安全培訓(xùn)考試(試題與答案)一、單項(xiàng)選擇題（每題1分，共30分。每題只有一個(gè)正確答案，請(qǐng)將正確選項(xiàng)字母填入括號(hào)內(nèi)）1.依據(jù)《新型冠狀病毒臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)生物安全指南（第二版）》，新冠病毒核酸檢測(cè)標(biāo)本滅活首選方法是（）A.56℃30min水浴B.75%乙醇浸泡10minC.紫外線照射30minD.121℃15min高壓蒸汽滅菌答案：A2.在PCR擴(kuò)增曲線中，Ct值與模板初始拷貝數(shù)的關(guān)系是（）A.Ct值越大，初始拷貝數(shù)越多B.Ct值與拷貝數(shù)無關(guān)C.Ct值越小，初始拷貝數(shù)越多D.Ct值與擴(kuò)增效率呈線性負(fù)相關(guān)答案：C3.下列哪項(xiàng)不是實(shí)時(shí)熒光PCR引物設(shè)計(jì)的基本原則（）A.避免二級(jí)結(jié)構(gòu)B.3′端避免連續(xù)G/CC.產(chǎn)物長(zhǎng)度50–150bpD.引物Tm值相差≥10℃答案：D4.關(guān)于生物安全柜（BSC-ⅡA2型）氣流特點(diǎn)，正確的是（）A.70%循環(huán)，30%外排，柜內(nèi)正壓B.30%循環(huán)，70%外排，柜內(nèi)負(fù)壓C.100%外排，無循環(huán)D.100%循環(huán)，無外排答案：B5.新冠核酸檢測(cè)中，內(nèi)標(biāo)基因選擇人類RNaseP的主要目的是（）A.監(jiān)測(cè)逆轉(zhuǎn)錄效率B.監(jiān)測(cè)標(biāo)本采集、提取及擴(kuò)增全過程C.監(jiān)測(cè)引物二聚體D.監(jiān)測(cè)試劑批間差答案：B6.以下哪項(xiàng)操作可導(dǎo)致PCR假陽性（）A.提取空白對(duì)照出現(xiàn)陽性信號(hào)B.擴(kuò)增產(chǎn)物開蓋分析后未清理工作臺(tái)面C.標(biāo)本滅活不完全D.以上均是答案：D7.依據(jù)WS/T641-2018，臨床PCR實(shí)驗(yàn)室各區(qū)域氣壓應(yīng)滿足（）A.標(biāo)本接收>核酸提取>擴(kuò)增>產(chǎn)物分析B.標(biāo)本接收<核酸提取<擴(kuò)增<產(chǎn)物分析C.標(biāo)本接收<核酸提取>擴(kuò)增<產(chǎn)物分析D.各區(qū)域等壓答案：B8.使用含胍鹽裂解液提取RNA時(shí)，加入無水乙醇的主要作用是（）A.沉淀蛋白質(zhì)B.沉淀RNAC.抑制RNaseD.溶解脂質(zhì)答案：B9.新冠病毒ORF1ab與N基因雙靶標(biāo)檢測(cè)，若ORF1abCt=38.5、N基因Ct=22.8，判定為（）A.陽性B.陰性C.可疑，需復(fù)檢D.無效答案：A10.關(guān)于脫卸個(gè)人防護(hù)裝備順序，正確的是（）A.外層手套→護(hù)目鏡→防護(hù)服→內(nèi)層手套→口罩B.護(hù)目鏡→外層手套→防護(hù)服→口罩→內(nèi)層手套C.外層手套→防護(hù)服→護(hù)目鏡→口罩→內(nèi)層手套D.防護(hù)服→外層手套→護(hù)目鏡→口罩→內(nèi)層手套答案：C11.實(shí)時(shí)熒光PCR中，F(xiàn)AM探針的淬滅基團(tuán)常用（）A.BHQ1B.TAMRAC.ROXD.CY5答案：B12.以下哪項(xiàng)不是PCR抑制物（）A.肝素B.血紅蛋白C.尿素D.Tris-HCl答案：D13.新冠核酸檢測(cè)結(jié)果報(bào)告時(shí)限，發(fā)熱門診標(biāo)本要求（）A.≤4hB.≤6hC.≤12hD.≤24h答案：B14.關(guān)于UN2814包裝系統(tǒng)，第二層包裝必須（）A.使用吸水材料B.使用金屬材質(zhì)C.使用透明袋D.使用可密封主容器答案：A15.以下哪項(xiàng)屬于PCR實(shí)驗(yàn)室“三區(qū)兩緩沖”中的“兩緩沖”（）A.標(biāo)本接收緩沖、產(chǎn)物分析緩沖B.試劑準(zhǔn)備緩沖、核酸提取緩沖C.核酸提取緩沖、擴(kuò)增緩沖D.試劑準(zhǔn)備緩沖、產(chǎn)物分析緩沖答案：B16.若陽性對(duì)照Ct值較平時(shí)升高2.5，首要考慮（）A.試劑失效B.擴(kuò)增儀孔位差異C.操作誤差D.探針降解答案：A17.新冠病毒核酸檢測(cè)標(biāo)本長(zhǎng)期保存溫度（）A.4℃B.?20℃C.?70℃D.室溫答案：C18.關(guān)于RNase抑制劑說法錯(cuò)誤的是（）A.可逆性結(jié)合RNaseB.對(duì)RNaseA、B、C均有效C.終濃度一般為1U/μlD.可替代DEPC水答案：D19.以下哪項(xiàng)不是PCR實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量指標(biāo)（）A.報(bào)告及時(shí)率B.假陽性率C.假陰性率D.標(biāo)本采集率答案：D20.在擴(kuò)增曲線平臺(tái)期，熒光信號(hào)不再上升的主要原因是（）A.引物耗盡B.dNTP耗盡C.酶失活D.以上均是答案：D21.關(guān)于新冠變異株奧密克戎（B.1.1.529）對(duì)PCR檢測(cè)的影響，正確的是（）A.S基因靶標(biāo)全部缺失B.N基因Ct值普遍降低C.現(xiàn)有ORF1ab/N雙靶標(biāo)檢測(cè)仍可有效檢出D.必須改用數(shù)字PCR答案：C22.以下哪項(xiàng)屬于BSL-2實(shí)驗(yàn)室必備設(shè)備（）A.生物安全柜B.動(dòng)物隔離器C.正壓防護(hù)服D.生命支持系統(tǒng)答案：A23.關(guān)于PCR防污染措施，錯(cuò)誤的是（）A.使用dUTP+UNG系統(tǒng)B.擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)安裝紫外燈C.試劑準(zhǔn)備區(qū)可處理提取后核酸D.定期用10%次氯酸擦拭工作臺(tái)面答案：C24.若室內(nèi)質(zhì)控品呈弱陽性，連續(xù)3天同一現(xiàn)象，應(yīng)首先（）A.更換質(zhì)控品批號(hào)B.校準(zhǔn)移液器C.更換試劑批號(hào)D.重新培訓(xùn)人員答案：A25.以下哪項(xiàng)不是新冠核酸檢測(cè)“假陰性”常見原因（）A.標(biāo)本采集過早B.提取效率低C.擴(kuò)增儀故障D.內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增失敗答案：D26.關(guān)于數(shù)字PCR優(yōu)勢(shì)，錯(cuò)誤的是（）A.無需標(biāo)準(zhǔn)曲線即可絕對(duì)定量B.抗抑制能力更強(qiáng)C.可檢測(cè)單拷貝D.通量高于熒光定量PCR答案：D27.新冠核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室空氣消毒首選（）A.0.5%過氧乙酸噴霧B.紫外線燈照射>1hC.75%乙醇噴灑D.臭氧消毒30min答案：A28.以下哪項(xiàng)屬于“氣溶膠”產(chǎn)生操作（）A.高速離心未配平B.移液器緩慢吸液C.標(biāo)本4℃靜置D.封膜機(jī)熱封答案：A29.關(guān)于實(shí)驗(yàn)室生物危害標(biāo)識(shí)，正確的是（）A.橙色背景，黑色生物符號(hào)B.紅色背景，白色生物符號(hào)C.藍(lán)色背景，白色生物符號(hào)D.黃色背景，黑色生物符號(hào)答案：D30.若標(biāo)本運(yùn)輸箱外表面被污染，首選消毒濃度（）A.500mg/L含氯消毒液B.1000mg/L含氯消毒液C.5000mg/L含氯消毒液D.75%乙醇答案：C二、多項(xiàng)選擇題（每題2分，共20分。每題有兩個(gè)或兩個(gè)以上正確答案，多選、少選、錯(cuò)選均不得分）31.以下哪些屬于PCR實(shí)驗(yàn)室“單向流動(dòng)”原則必須滿足的要求（）A.試劑準(zhǔn)備區(qū)→核酸提取區(qū)→擴(kuò)增區(qū)B.人員流向與標(biāo)本流向一致C.物品流向可逆向D.空氣流向從清潔到污染答案：A、D32.可導(dǎo)致熒光PCR假陰性的抑制因素包括（）A.肝素鈉B.血紅蛋白C.滑石粉D.瓊脂糖答案：A、B、C33.關(guān)于新冠病毒核酸檢測(cè)標(biāo)本采集，正確的是（）A.咽拭子需雙側(cè)扁桃體擦拭B.鼻咽拭子插入深度為鼻尖到耳垂距離C.采集后放入病毒保存液D.4℃保存不超過24h答案：A、B、C、D34.以下哪些屬于BSL-2實(shí)驗(yàn)室個(gè)人防護(hù)裝備（）A.醫(yī)用防護(hù)口罩B.雙層手套C.防水圍裙D.正壓呼吸器答案：A、B、C35.關(guān)于UNG酶防污染系統(tǒng)，正確的是（）A.識(shí)別并切割含dU的DNAB.在PCR前步驟起作用C.對(duì)RNA無影響D.可完全替代分區(qū)操作答案：A、B、C36.以下哪些情況需啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)室污染排查（）A.陰性對(duì)照出現(xiàn)S型擴(kuò)增B.陽性對(duì)照Ct值降低C.空白對(duì)照Ct=38D.連續(xù)3個(gè)標(biāo)本同靶標(biāo)Ct相同答案：A、C37.關(guān)于新冠病毒基因變異對(duì)PCR的影響，正確的是（）A.單堿基突變可能導(dǎo)致引物結(jié)合失敗B.探針3′端突變對(duì)信號(hào)影響更大C.雙靶標(biāo)可顯著降低漏檢風(fēng)險(xiǎn)D.所有突變均導(dǎo)致假陰性答案：A、B、C38.以下哪些屬于實(shí)驗(yàn)室“性能驗(yàn)證”指標(biāo)（）A.精密度B.檢出限C.線性范圍D.參考區(qū)間答案：A、B、C39.關(guān)于標(biāo)本溢灑處理，正確的是（）A.立即用吸水紙覆蓋B.5000mg/L含氯消毒液作用30minC.從污染區(qū)向中心區(qū)傾倒消毒液D.處理完再撤離人員答案：A、B40.以下哪些屬于實(shí)驗(yàn)室生物安全事故（）A.離心管破裂產(chǎn)生氣溶膠B.銳器傷導(dǎo)致血液暴露C.防護(hù)服破損且皮膚接觸標(biāo)本D.紫外線燈誤照5min答案：A、B、C三、填空題（每空1分，共20分）41.依據(jù)《人間傳染的病原微生物名錄》，新冠病毒未經(jīng)培養(yǎng)的感染標(biāo)本按危害程度分類為第____類，運(yùn)輸包裝分類為____。答案：三；UN337342.實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增效率應(yīng)在____%–____%之間，相關(guān)系數(shù)R2≥____。答案：90；110；0.9943.病毒保存液常規(guī)添加抗生素為____和____，終濃度分別為____U/ml和____μg/ml。答案：青霉素；鏈霉素；100；10044.依據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測(cè)工作手冊(cè)（試行第二版）》，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)每____批次檢測(cè)至少設(shè)置____份陽性質(zhì)控、____份陰性質(zhì)控和____份空白對(duì)照。答案：1；1；1；145.生物安全柜使用前需先開機(jī)自凈____min，工作面風(fēng)速應(yīng)達(dá)____m/s。答案：15；0.3646.10%次氯酸鈉溶液有效氯濃度約為____mg/L，稀釋____倍后得1000mg/L。答案：100000；10047.新冠病毒核酸檢測(cè)結(jié)果報(bào)告應(yīng)使用____字體，字號(hào)不小于____號(hào)。答案：宋體；小四48.依據(jù)《臨床檢驗(yàn)定量測(cè)定項(xiàng)目精密度與正確度驗(yàn)證》，重復(fù)測(cè)定____天、每天____批次、每批次____次，方可完成精密度驗(yàn)證。答案：5；1；249.若標(biāo)本采集后24h內(nèi)無法檢測(cè)，應(yīng)置于____℃保存，最長(zhǎng)不超過____天。答案：?70；750.脫卸防護(hù)裝備后，應(yīng)執(zhí)行____步洗手法，洗手時(shí)間不少于____秒。答案：七；40四、判斷題（每題1分，共10分。正確打“√”，錯(cuò)誤打“×”）51.新冠病毒核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室可與其他病毒檢測(cè)項(xiàng)目共用擴(kuò)增儀。（）答案：×52.生物安全柜內(nèi)可明火操作，以加速干燥。（）答案：×53.實(shí)時(shí)熒光PCR的Ct值與模板初始量對(duì)數(shù)呈線性負(fù)相關(guān)。（）答案：√54.實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)假陽性最常見原因是標(biāo)本間交叉污染。（）答案：√55.病毒保存液pH值應(yīng)維持在6.8–7.4之間。（）答案：√56.擴(kuò)增曲線呈“S”型但Rf值<0.9可報(bào)告陽性。（）答案：×57.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，可立即關(guān)閉生物安全柜并離開。（）答案：×58.實(shí)驗(yàn)室人員離崗前需進(jìn)行鼻咽拭子新冠病毒核酸篩查。（）答案：√59.數(shù)字PCR可直接給出拷貝數(shù)/μl，無需標(biāo)準(zhǔn)曲線。（）答案：√60.防護(hù)服如有小面積污染，可用75%乙醇擦拭后繼續(xù)使用。（）答案：×五、簡(jiǎn)答題（共30分）61.（封閉型，6分）簡(jiǎn)述實(shí)時(shí)熒光PCR出現(xiàn)“翹尾”曲線的三種常見原因及糾正措施。答案：（1）探針濃度過低→提高探針終濃度至200–250nM；（2）引物二聚體干擾→重新設(shè)計(jì)引物或提高退火溫度2℃；（3）儀器基線設(shè)置不當(dāng)→手動(dòng)調(diào)整基線起始循環(huán)至2–6。62.（封閉型，6分）列舉實(shí)驗(yàn)室發(fā)生標(biāo)本溢灑導(dǎo)致氣溶膠污染的應(yīng)急處置六步法。答案：①立即停機(jī)并告知同伴；②用吸水紙覆蓋溢灑區(qū)；③配制5000mg/L含氯消毒液，從外向內(nèi)傾倒，作用30min；④雙層收集污染物，置于生物危害袋；⑤用同濃度消毒液擦拭周邊1m范圍；⑥開啟紫外燈>1h并填寫事故記錄。63.（開放型，8分）結(jié)合工作實(shí)際，分析新冠核酸檢測(cè)“假陰性”五大環(huán)節(jié)并提出改進(jìn)方案。答案：環(huán)節(jié)與改進(jìn)：（1）采集時(shí)機(jī)——癥狀出現(xiàn)24–48h采集，避免潛伏期過早；（2）采集方法——培訓(xùn)采樣人員，確保雙側(cè)咽+鼻咽拭子；（3）運(yùn)輸保存——4℃≤4h，超時(shí)?70℃；（4）提取效率——采用內(nèi)標(biāo)病毒樣顆粒監(jiān)控提取，磁珠法改為旋轉(zhuǎn)柱法；（5）擴(kuò)增抑制——稀釋模板10倍、添加BSA至0.1μg/μl、使用UNG+dUTP系統(tǒng)。64.（封閉型，5分）計(jì)算：某試劑盒靈敏度驗(yàn)證數(shù)據(jù)為10copies/μl、20重復(fù)檢出19次，求95%置信區(qū)間檢出率，并判斷是否合格（要求≥95%）。答案：檢出率p=19/20=0.95，95%置信區(qū)間：p±1.96√[p(1?p)/n]=0.95±0.097，區(qū)間0.853–1.000；下限85.3%<95%，故暫不合格，需擴(kuò)大樣本量至60次。65.（開放型，5分）簡(jiǎn)述實(shí)驗(yàn)室如何在24h內(nèi)完成從“10合1混采”到單檢復(fù)核全流程，并保證質(zhì)量。答案：流程：①接收混采管→掃碼入庫(kù)→4℃暫存；②批量滅活56℃30min；③96通道自動(dòng)提取+PCR，3h出初篩；④陽性組立即拆管，原保存液?70℃取50μl單獨(dú)提取；⑤單檢使用快速試劑（45min擴(kuò)增）；⑥結(jié)果雙審核、LIS直報(bào)；⑦每批次加1份陽性質(zhì)控、1份陰性質(zhì)控、1份空白；⑧人員兩班倒，設(shè)備24h運(yùn)行，每4h校準(zhǔn)一次移液器。六、案例分析題（共40分）66.（綜合類，20分）背景：某實(shí)驗(yàn)室一日內(nèi)出現(xiàn)以下結(jié)果：標(biāo)本A：ORF1abCt=25.8，N基因Ct=26.0，內(nèi)標(biāo)Ct=28.5；標(biāo)本B：ORF1abCt=38.2，N基因陰性，內(nèi)標(biāo)Ct=29.0；陰性對(duì)照：ORF1abCt=38.5，N基因陰性；陽性對(duì)照：ORF1abCt=19.0，N基因Ct=19.2；空白對(duì)照：無擴(kuò)增。問題：（1）判定各標(biāo)本結(jié)果并說明依據(jù)；（6分）（2）分析陰性對(duì)照出現(xiàn)信號(hào)的可能原因；（4分）（3）提出系統(tǒng)排查與糾正措施；（6分）（4）若需復(fù)檢，寫出復(fù)檢方案。（4分）答案：（1）標(biāo)本A：雙靶標(biāo)陽性，Ct<40，內(nèi)標(biāo)正常，報(bào)告陽性；標(biāo)本B：?jiǎn)伟袠?biāo)可疑，依據(jù)指南需復(fù)檢。（2）陰性對(duì)照Ct=38.5，提示低水平污染，可能為氣溶膠或試劑污染。（3）排查：①更換試劑批號(hào)重做陰性對(duì)照；②提取空白、擴(kuò)增空白分別放置；③紫外照射臺(tái)面1h；④更換移液器濾芯；⑤人員重新培訓(xùn)脫卸流程。（4）復(fù)檢方案：標(biāo)本B原提取液復(fù)測(cè)，同時(shí)重新采樣；若復(fù)測(cè)ORF1ab仍≥38且N基因陰性，則報(bào)告陰性；若Ct<38或N基因陽性，則報(bào)告陽性并送疾控測(cè)序。67.（計(jì)算+分析類，20分）實(shí)驗(yàn)室新引入國(guó)產(chǎn)試劑盒，說明書聲稱檢出限為500copies/ml。現(xiàn)用WHO標(biāo)準(zhǔn)品（濃度1000IU/ml，換算系數(shù)1IU=1copy）進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：將標(biāo)準(zhǔn)品用陰性鼻咽拭子保