Nanopore-technique-納米孔測序課件

Nanoporetechnique發展歷史PARTONE理論提出：>>使用納米孔作為生物傳感器的想法是從20世紀90年代開始由幾個小組提出的（Church

etal.,submitted1995,published1998;

Kasianowicz

etal.,1996）>>研究人員證實，通過納米孔的離子電流取決于與納米孔相互作用和傳遞的核酸堿基種類

(Akeson

etal.,1999;

Derrington

etal.,2010;

Manrao

etal.,2011;

Wallace

etal.,2010)>>納米孔還能依次核酸分子中堿基的順序。（Akeson

etal.,1999;Bayley

etal.,2006;

Laszlo

etal.,

2014;Song

etal.,1996)。付出實踐：>>牛津納米波爾技術成立于2005年，目的是將這些概念證明研究轉化為商用的第三代測序設備。這是一種可以檢測單鏈DNA分子堿基通過納米孔的裝置，它的宣稱沒有理論上的閱讀長度限制(除了在樣品制備過程中引入的)，在2012年的基因組生物學和技術會議上受到了熱烈的歡迎。(CheckHayden,2012;

Eisenstein,2012)Nature：首次！納米孔測序讓流感病毒終于“無所遁形”2018.4.26（1）變革前的“RNA測序”許多病毒（包括脊髓灰質炎病毒、埃博拉病毒以及普通感冒病毒）將其遺傳信息存儲為RNA，而非DNA。幾乎所有的“RNA測序”都使用一種叫做逆轉錄酶的病毒酶，它通過將RNA轉到到DNA鏈中完成測序，而這種傳統的“RNA測序”技術自20世紀70年代被發明以來就未改變過，這一技術缺陷也導致沒有人對上述病毒的RNA基因組進行直接測序。（2）微小但強大今年1月，英國牛津納米技術公司）的研究人員使用一種名為MinION的巧克力棒大小的設備，直接對RNA進行測序。這項研究著眼于信使RNA（一個傳遞來自DNA的信息以構建蛋白質的RNA分子家族）的轉錄物。Barnes的團隊將這種方法應用于甲型流感的基因組（3）技術瓶頸鑒定RNA化學修飾的方法。到目前為止，研究人員已經發現了100多種，但他們幾乎不知道其中的大部分在做什么，而這很大程度上是因為不可能對它們進行一個系統的研究。應用即時檢測傳染源太空應用非整倍體檢測文獻記載從樣品準備到發現致病菌只需要6小時時間，而從樣品放置機器到發現致病菌只需要4分鐘。文章列舉了截至目前用MinION測序儀涉及研究的物種及詳細描述了西非爆發埃博拉病毒時，MinION測序方法在病毒檢測過程中起到的重要作用。在胎兒非整倍體產前檢測中發揮重要作用。利用正常平臺，通常需要1-3周時間獲得結果。而利用MinION測序方法，文獻報道只需要4小時在太空飛行中，發掘細菌和病毒是很困難的事情。大部分研究是將樣品帶回地球進行測序鑒定。目前，準備利用MinION測序儀在國際空間站進行病菌的實時測序PARTTWOPrinciples/video/av12871119?share_medium=android&share_source=copy_link&bbid=AWIANlRjAjYPbV9oFCYUJhQtHn1LekgpTDBRinfoc&ts=1539249913753TheOxfordNanoporesequencingprocessSuspendedlibrarymoleculesareconcentratednearnanoporesembeddedinthemembrane.Avoltageappliedacrossthemembraneinducesacurrentthroughthenanopores.Schematicofalibrarymolecule,showingdsDNAligatedtoaleaderadapterpre-loadedwithamotorproteinandahairpinadapterpre-loadedwithahairpinprotein,andthetetheringoligos.AllpicturesofthissectionarefromMinIONAnalysisandReferenceConsortium:Phase1datareleaseandanalysis.Sequencingstartsfromthe5’endoftheleaderadapter.ThemotorproteinunwindsthedsDNAallowingsingle-strandedDNAtopassthroughthepore.Aflowcellcontains512channels(grey),eachchannelconsistingof4wells(white).Eachwellcontainsapore(blue)andasensor.Atanygiventime,thedeviceisrecordingthedatastreamfromthewellsoftheactivewell-group,inthisexample,g1.TheOxfordNanoporesequencingprocessPerturbationinthecurrentacrossthenanoporeismeasured3,000timespersecondasssDNApassesthroughthenanopore.The‘bulkdata’aresegmentedintodiscrete‘events’ofsimilarconsecutivemeasurements.The5-mercorrespondingtoeacheventisinferredusingastatisticalmodel.TheOxfordNanoporesequencingprocessThe1Dbase-callsareinferredseparatelyforthetemplateandcomplementeventsignals.Alignmentofthe2Dbase-callsfromtheeventsignalsfromboth,andthe1Dbase-callsareusedtoconstrainthe2Dbase-calls.TheOxfordNanoporesequencingprocessTheworkflowFromOxfordNanoporetechniqueofficialwebsiteBiologicalnanoporesTypesofNanoporesSolid-statenanoporesα-hemolysin(α-溶血素）Msp-A(恥垢分枝桿菌孔蛋白A)Biologicalnanopore——α-hemolysin(α-溶血素）Fromwikipedia

α-hemolysinisachannel-formingtoxinreleasedbyStaphylococcusaureus,whichcanformatransmembraneheptamersnanoporeoneukaryoticcellmembranesandotherlipidbilayers.α-hemolysinisaheptamericproteinporewithaninnerdiameterof1nm,about100,000timessmallerthanthatofahumanhair.Thisdiameteristhesamescaleasmanysinglemolecules,includingDNA.Msp-A(分枝桿菌孔蛋白A)MycobacteriumsmegmatisporinA(MspA)isthesecondbiologicalnanoporecurrentlybeinginvestigatedforDNAsequencing.TheMspAporehasbeenidentifiedasapotentialimprovementoverαHLduetoamorefavorablestructure.ProteinimagefromOPMdatabaseAnaturalMspA,whilefavorableforDNAsequencingbecauseofshapeanddiameter,hasanegativecorethatprohibitedsinglestrandedDNA(ssDNA)translocation.Thenaturalnanoporewasmodifiedtoimprovetranslocationbyreplacingthreenegativelychargedasparticacidswithneutralasparagines.TheelectriccurrentdetectionofnucleotidesacrossthemembranehasbeenshowntobetenfoldmorespecificthanαHLforidentifyingbases.Solid-stateNanopores——FuturegenerationsofnanoporesFromOxfordNanoporetechniqueofficialwebsiteAsolid-statenanoporeistypicallyananometer-sizedholeformedinasyntheticmembrane(usuallySiNxorSiO2).Theporeisusuallyfabricatedbyfocusedionorelectronbeams,sothesizeoftheporecanbetunedfreely.HybridporesGraphene(石墨烯)Thefinedepthofthegraphenemembraneprovidesoptimalspatialreso