分子標記概述2003

DNA分子標記目錄概述1.常用分子標記技術原理及操作2.幾種分子標記方法比較3.分子標記在園藝植物中的應用4.1、基本概念遺傳標記指可追蹤染色體、染色體某一節段或者某個基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。是表示遺傳多樣性的有效手段，可以明確反映遺傳多態性的生物特征。它具有兩個基本特征，即可遺傳性和可識別性。分子標記是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，直接在DNA水平上檢測生物個體之間的遺傳差異，是DNA水平遺傳多態性的直接的反映常用遺傳標記的類型細胞學標記生化標記分子標記3形態標記124廣義的分子標記是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質分子標記狹義分子標記是指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段DNA分子標記的優勢直接以DNA的形式表現，在生物體的各個組織、各個發育階段均可檢測到，不受季節、環境限制，不存在表達與否等問題自然界存在許多等位變異，無需人為創造，多態性高遍布整個基因組，可檢測的基因座位是無限的理想的分子標記具有高的多態性共顯性遺傳檢測手段簡單快速選擇中性分子標記均勻分布于整個基因組能明確辨別等位基因遍布整個基因組成本低，重復性好以PCR為基礎的分子標記技術例如SSR（1982）RAPD（1990）AP-PCR（1990）AFLP（1993）ISSR（1994）SAGE（1995）第二類分子標記以Southern雜交為基礎的分子標記技術例如RFLP（1974）第一類分子標記以單核苷酸多態性為基礎的分子標記技術

例如SNP（1998）SRAP（2001）TRAP（2003）第三類分子標記DNA分子標記產生的分子基礎PCR技術基因組DNA限制性內切酶引物DNA聚合酶帶電荷的物質在電場中的趨向運動電泳核酸分子由于帶負電荷，在電場中向陽極定向運動核酸電泳PCR反應步驟高溫變性低溫退火中溫延伸使DNA雙鏈解開讓引物與單鏈模板互補結合以互補的引物為復制起點，dNPTs為原料，進行復制。

核酸電泳常用分子標記方法SSRRAPDSRAPISSRRFLPSNPRFLP標記法（RestrictionFragmentLengthPolymorphism）不同材料的DNA用已知的限制性內切酶消化后，產生許多大小不等的DNA片段，電泳分離、Southern印跡轉移到硝酸纖維膜上，用放射性標記的探針與膜上變性的酶切DNA進行雜交，放射自顯影，即可顯示出不同材料的多態性圖譜，即顯示出所分析的DNA序列間

原理

RFLP標記特點

遍布，無限不受外界環境、發育階段、器官等影響探針多DNA需求量大，純度高技術要求高，成本大RFLP標記基本步驟DNA雜交及放射自顯影Southern印記轉移瓊脂糖凝膠電泳酶切DNA的分離

RAPD標記法（RandomAmplifiedPolymorphismDNA）以PCR技術為基礎，以一系列人工合成的不同的隨機排列順序的寡聚核苷酸單鏈（通常為十聚體）為引物對所研究的基因組DNA進行PCR酶促體外擴增，擴增產物通過聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠電泳分離，經EB染色（或銀染、放射自顯影）來檢驗擴增產物DNA片段的多態性。擴增片段多態性便反映了基因組相應區域的DNA多態性。原理RAPD標記特點試驗步驟少沒有物種特異性技術簡便DNA樣品量少存在共遷移問題重復性不高顯現標記易發現多態性ADNA的提取B用隨機引物對兩個相對性狀個體進行PCR擴增C用凝膠電泳分開產物DNA片段D查找特異的與目的性狀共分離的DNA片段RAPD標記基本步驟SSR標記法（simplesequencerepeat）根據微衛星序列兩端互補序列設計引物，通過PCR反應擴增微衛星片段，由于核心序列串聯重復數目不同，因而能夠用PCR的方法擴增出不同長度的PCR產物，將擴增產物進行凝膠電泳，根據分離片段的大小決定基因型并計算等位基因頻率。

原理SSR原理

?

重復單元：1~6bp,如

CA,CTCG

?

重復次數：5~30次

?

覆蓋長度：10~300bpSSR標記特點1.數量多且平均分布2.位于內含子中3.共顯現遺傳4.結果重復性高5.引物問題SSR標記的步驟TwoThreeOne構建小片段或大片段的基因組篩選陽性克隆測序、設計引物、優化PCR反應條件，獲得的陽性克隆經過確認后，全部或經過隨機挑選后測序，然后根據微衛星序列兩側保守區域的序列設計引物，優化PCR擴增的條件，獲得穩定、可靠的SSR標記。ISSR標記法（inter-simplesequencerepeat）在SSR的3’或5’端加錨1~4個嘌呤或嘧啶堿基,引起特定位點退火,使引物與匹配SSR的一端結合,從而對基因組中特定片段進行擴增、檢測,最后根據譜帶的有無及相對位置分析不同樣品間ISSR標記的多態性。原理

5’錨定引物3’錨定引物

NNNN（CA）n（CA）nNNCACACACACACAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCACACACACACACACA

NNn（CA）

（CA）nNNNN3’錨定引物5’錨定引物

3’錨定引物的PCR產物5’錨定引物的PCR產物ISSR標記特點FiveFourThreeTwoOne技術簡單檢測迅速，容易靈敏度高，特異性強具有高的多態性

穩定可靠，重復性好用6%的聚丙烯酰胺進行電泳分離，用EB或銀染后放入可見光或紫外光下觀察，統計帶紋的有無及相對位置。在PCR儀上對基因組中的SSR間序列進行擴增。擴增步驟與RAPD技術相似,但不同引物、不同植物材料的擴增條件存在差異,需通過預備實驗對體系反應加以設計可采用常規方取用于ISSR分析的DNA樣品,如SDS法或CTAB法DNA提取PCR擴增電泳檢測SRAP標記法（Sequence—relatedAmplifiedPolymorphism）

利用基因外顯子里G、C含量豐富，而啟動子和內含子里A、T含量豐富的特點設計兩套引物，對開放讀碼框架（ORFs）進行擴增。原理SRAP標記特點技術簡單快速引物設計簡單具高多態性信息量豐富在基因組中分布均勻穩定可靠重復性好ONETWOTHREEFOURSRAP標記的引物設計SRAP-PCR擴增凝膠電泳分析擴增產物檢測與片段測序

SRAP標記的步驟SNP標記（SingleNucleotidePolymorphism）原理

單個核苷酸的變異而引起基因組水平上的DNA序列多態性，形式包括單堿基的缺失、插入、轉換及顛換等

不同生物個體基因組DNA序列之間單個核苷酸的差異，這種差異可以通過設計特異PCR引物擴增和電泳檢測顯示出來。位點豐富、分布廣泛具有更高的遺傳穩定性，尤其是處于編碼區的SNP檢測快速、易于實現自動化分析富有代表性二態性和等位基因性SNP標記特點6種分子標記方法比較DNA質量要求DNA檢測范圍遺傳特點多態性技術難度及重復性RFLP高低拷貝區共顯性中等高、高RAPD低整個基因組顯性較高中等、低SSR中高重復序列區共顯性高低、高ISSR中高重復序列區顯性高低、低SRAP低整個基因組共顯性高低、低SNP高整個基因組共顯性高高、高RFLP標記的應用

構建基因組遺傳圖譜及育種1

基因定位及基因突變分析

2

遺傳多態性分析3

細胞質遺傳研究4莊杰云等選用覆蓋整個水稻遺傳圖譜的129和106個DNA探針,分別分析了汕稻品系IR54、5460、5460S之間和粳稻品系農墾58

、農墾58s及其育性回復突變系之間的RFLp。結果表明人工誘變能引起水稻染色體組各座位同時發生廣泛的非致死性突變;自發突變較普遍,且多為回復突變。農墾58等3個粳稻品系之間的差異較小,但具有類似的趨勢。應用舉例RAPD標記的應用天然居群內及居群間的遺傳變異種質資源搜集及品種鑒定種間或屬間親緣關系遺傳圖譜構建基因定位與分離等尹艷杰等利用RAPD標記分析了桂林市23個桂花品種的親緣關系，研究表明，4個品種群內的不同品種間的親緣關系接近，而不同品種群間親緣關系較遠。其中圓瓣金桂、桃葉金桂、湘金桂、金蓮首先聚為一類，被命名為金桂品種群;南溪丹桂、貴妃紅、籽丹桂、丹心被劃分為丹桂品種群:四季桂、月月桂屬于四季桂品種群，其余的品種，如紫粵、滿天星、弄潮兒等都屬于銀桂品種群應用舉例SSR標記的應用生物雜交育種及純度鑒定01遺傳連鎖圖譜02種群遺傳多樣性03系統發生等04應用舉例

張敏等采用SSR標記技術，選用100對引物在鄂茄子2號親本間進行PCR擴增．從中篩選出的3對引物SMl7、SM29、SM51在雙親本間能夠擴增出差異互補的條帶。利用這3對引物對鄂茄子2號雜種一代群體進行純度鑒定，鑒定結果為97．1％；與同批次種子的田間鑒定結果(96．1％)接近，說明應用SSR分子標記技術實施茄子雜種一代種子的純度鑒定是可行的．ISSR標記的應用群體遺傳結構和遺傳多樣性研究遺傳作圖與基因定位品種和種質鑒定物種和種群親緣關系研究品種純度鑒定李嚴龍等將金葉女貞和平抗金葉女利用ISSR分子標記技術，鑒定發生變異的平抗金葉女貞品種。結果表明，平抗金葉女貞為金葉女貞品種在某一基因位點發生基因突變產生的單位點自然變異品種。應用舉例SRAP標記的應用1

構建遺傳圖譜2

遺傳多樣性分析3

比較基因組學4

標定基因等楊建用RAP分子標記，以鵝掌楸種間雜交(BMxS)Fl代群體為材料，構建了一張鵝掌楸分子標記連鎖遺傳圖。并