ISO 13319-22023 粒度分布的測定電感區法第2部分可調諧電阻脈沖傳感法標準立項發展報告

粒度分布的測定電感區法第2部分：可調諧電阻脈沖傳感法標準立項發展報告StandardizationDevelopmentReport:DeterminationofParticleSizeDistribution—ElectricalSensingZoneMethod—Part2:TunableResistivePulseSensingMethod摘要粒度分布是表征顆粒材料物理特性的核心參數，廣泛涉及制藥、生物技術、材料科學、環境監測及食品工業等領域。本報告基于國際標準ISO13319-2:2023《粒度分布的測定電感區法第2部分：可調諧電阻脈沖傳感法》編制，系統闡述了該標準的立項背景、技術原理、核心內容、標準結構、國際協調性及應用前景。可調諧電阻脈沖傳感（TunableResistivePulseSensing,TRPS）技術通過可調諧微納孔徑對單個顆粒進行逐個檢測，實現了納米至微米級顆粒的粒徑、濃度及表面電荷多參數同步測量，彌補了傳統電感區法（如庫爾特計數法）在亞微米尺度靈敏度不足的局限。本報告梳理了TRPS技術的工作原理、關鍵性能指標（包括測量范圍、分辨率、重現性等）、與現有標準體系的銜接關系，以及該國際標準對全球顆粒表征技術體系的重要補充價值。本報告同時探討了TRPS技術在細胞外囊泡表征、納米藥物質量控制、病毒載體監測等前沿領域的應用潛力，并展望了我國在該標準框架下的本土化實施路徑與未來標準化工作方向。關鍵詞：粒度分布；電感區法；可調諧電阻脈沖傳感；ISO13319-2；顆粒表征；納米顆粒Keywords:particlesizedistribution;electricalsensingzonemethod;tunableresistivepulsesensing;ISO13319-2;particlecharacterization;nanoparticles1引言顆粒材料的粒度分布直接決定其物理化學性能與應用價值，粒度測量也因此成為制藥、化工、電子、環境等眾多行業質量控制與科學研究不可或缺的手段。在眾多粒度測量方法中，電感區法（ElectricalSensingZoneMethod,ESZ）因其原理直觀、計數統計可靠性高而長期占據重要地位，經典的庫爾特計數器即為此類方法的代表。然而，隨著納米技術與生物醫藥技術的迅猛發展，傳統電感區法在可測量粒徑下限、單顆粒多參數同步表征等方面日益暴露出局限性。在這一技術演進背景下，可調諧電阻脈沖傳感（TRPS）技術應運而生。TRPS技術采用可形變的聚氨酯微孔膜，通過機械拉伸調控孔徑大小，使得單一傳感孔可在數十納米至數微米的寬范圍內實現粒徑可調測量，同時一一記錄每個顆粒通過納米孔時產生的電阻脈沖信號，從而同步獲取顆粒的粒徑、濃度與表面電荷信息。這項技術自21世紀初商業化以來，在細胞外囊泡（EV）表征、納米藥物遞送系統分析、病毒與細菌檢測、膠體穩定性評估等應用中展現出獨特優勢。為將這一先進方法上升為國際公認的標準測試程序，國際標準化組織（ISO）在ISO13319系列框架下啟動了第2部分的編制工作。經過多年技術驗證與多輪國際協商，ISO13319-2:2023于2023年9月正式發布。該標準的出臺不僅填補了TRPS技術在粒度分析標準體系中的空白，也為納米顆粒表征提供了首個基于單顆粒電阻脈沖原理的國際通用規范。2標準制定背景與過程2.1電感區法標準體系的發展沿革ISO13319系列標準是ISO/TC24/SC4（粒度分析與篩分技術委員會）下屬的核心標準之一。首版ISO13319:2007《粒度分布的測定電感區法》以傳統庫爾特原理為基礎，規定了使用電解液中的小孔對懸浮顆粒進行計數與體積測量的方法。該標準在微米級顆粒表征領域發揮了重要作用，被廣泛應用于血液細胞計數、乳劑粒徑評價、磨料粒度檢驗及地質樣品分析等場景。然而，ISO13319:2007所適用的測量下限通常止于0.6μm左右，對于當下熱點研究領域——如細胞外囊泡（直徑約50–1000nm）、功能化納米顆粒（直徑20–500nm）及脂質體藥物載體（直徑約50–300nm）——該方法的靈敏度明顯不足。此外，傳統電感區法無法在計數同時對顆粒表面電荷進行量化評估，這在一定程度上制約了其在膠體科學和生物醫學中的深入應用。2.2TRPS技術的標準化需求TRPS技術最初源于20世紀90年代末的電阻脈沖傳感基礎研究，后經商業化發展形成了較成熟的儀器平臺。與傳統的固定孔徑電感區法相比，TRPS技術具備以下獨特性：-孔徑可調：通過拉伸彈性膜改變孔徑尺寸，實現同一平臺上從納米到微米的寬測量跨度；-單顆粒逐一測量：每個顆粒通過孔徑時產生獨立的電阻脈沖，可實現高分辨率的粒度分布統計；-多參數同步獲取：脈沖幅度對應粒徑大小，脈沖頻率換算出顆粒濃度，脈沖的半寬信息與表面電荷密度相關聯，實現"一次測量、多參數輸出"。基于上述特點，TRPS技術在生物顆粒表征領域迅速獲得重視。2010年前后，細胞外囊泡研究呈現爆發式增長，而傳統的NTA（納米顆粒追蹤分析）和動態光散射（DLS）方法在濃度精確度和單顆粒分辨率方面存在固有局限。TRPS以其絕對計數能力和粒徑高通量分辯優勢，逐步成為細胞外囊泡表征的重要參考方法。技術的不斷發展對標準化提出了迫切需求：不同實驗室間的TRPS測量結果缺乏可比性，儀器校準方法、樣品制備流程以及數據處理準則亟需統一。正是在此背景下，ISO/TC24/SC4于2016年前后啟動TRPS標準化預研工作，并于2018年正式立項編制ISO13319-2。2.3編制歷程ISO13319-2:2023的編制歷經約五年的技術討論與驗證。起草工作主要由德國、中國、美國、日本、英國等成員體的專家共同承擔。標準編制過程中，專家組圍繞以下關鍵議題進行了深入探討：1.校準物質的選擇與溯源：確立了使用NIST可溯源標準聚苯乙烯乳膠微粒進行粒徑校準的程序；2.電解質溶液配方的標準化：規范了溶液的電導率范圍、表面活性劑添加種類及濃度，以降低顆粒團聚和膜潤濕不穩定性的影響；3.孔徑可調性與測量條件之間的耦合關系：明確了在不同膜拉伸條件下各測量參數（如施加電壓、壓力、頻率）的適宜范圍；4.濃度測量不確定度的評定方法：確立了基于泊松計數統計和儀器采樣體積校準相結合的不確定度評估框架。經過工作組草案（WD）、委員會草案（CD）、國際標準草案（DIS）和最終國際標準草案（FDIS）各階段評審和投票，標準于2023年9月19日正式發布。3標準主要內容解析3.1標準范圍與適用對象ISO13319-2:2023適用于采用可調諧電阻脈沖傳感技術對懸浮于電解質溶液中的顆粒進行粒徑分布及顆粒濃度測定的場景。標準所覆蓋的典型粒徑范圍為50nm至10μm，但這一范圍并非絕對邊界——通過選擇合適的膜孔徑和儀器配置，可將測量范圍進一步擴展至數十納米以下或數十微米以上。標準適用于但不限于以下樣品類型：-細胞外囊泡（外泌體、微囊泡等）；-病毒樣顆粒及腺相關病毒（AAV）載體；-脂質體、聚合物納米粒和乳劑；-無機納米顆粒（如二氧化硅、氧化鐵、金納米顆粒）；-細菌和亞微米級微生物。3.2術語和定義該標準對以下關鍵術語進行了明確定義：-可調諧電阻脈沖傳感：一種基于彈性膜微孔的電感區測量技術，通過調節膜拉伸程度改變孔徑大小，從而實現粒徑范圍可調的測量；-脈沖幅度：顆粒通過傳感孔時產生的電阻變化量，與顆粒體積成正比；-阻塞幅度：基線電流瞬時減少的比例，是粒徑計算的基礎物理量；-顆粒濃度：由單位時間內的脈沖計數頻率與已知流量率計算得出的每單位體積顆粒數。3.3方法原理TRPS的測量原理可歸結為庫爾特原理的納米化、柔性化延伸。其核心構件是一張厚度約數十微米的彈性聚氨酯膜，膜上通過可控擊穿方式制備一個納米至亞微米級的小孔。測量時，膜兩側充滿電解質溶液，施加恒定電壓后電流經小孔流過。當顆粒隨液流通過小孔時，由于顆粒的電導率通常低于電解質溶液，孔的等效電阻增大，進而產生一個瞬時的電流下降脈沖——即電阻脈沖。TRPS方法的獨特之處在于膜的可拉伸結構設計——通過精密機械裝置對彈性膜施加可控制的機械張力，改變膜的平面內形變從而調控孔徑大小。當膜被拉伸時，孔的截面積增大，允許更大粒徑的顆粒通過；反之，減小拉伸量可恢復較小孔徑。這種"可調諧"能力使儀器無需更換傳感裝置即可對較寬粒徑范圍進行連續掃描測量。在該標準中，測量條件如施加壓力（通常為0.1–10kPa）、電壓（通常為1–10V）和膜拉伸比需要經過系統優化，方可在避免顆粒剪切損傷的前提下獲得穩定且高信噪比的脈沖信號。標準推薦了一條結構化優化路徑，包括：預實驗確定適宜脈沖幅值范圍、選擇適當的稀釋倍數（避免顆粒聚集和重合事件）、評估壓力對濃度測量準確性的影響等。3.4儀器要求與校準標準對TRPS儀器的性能指標提出了明確要求，包括：-粒徑分辨力：標準要求儀器對單分散標準顆粒的粒徑測量變異系數（CV）不得超過5%；-濃度線性度：在儀器標稱測量范圍內，顆粒濃度測量的線性相關系數應不低于0.99；-計數效率穩定性：長時間連續測量過程中的計數漂移應控制在±3%以內。儀器校準方面，標準規定采用直徑分別為100nm、200nm、400nm及800nm的NIST溯源聚苯乙烯微粒（或同等標準物質）構建校準曲線。每種標準顆粒需在至少三個不同膜孔徑設定下進行測量，以驗證粒徑測量在不同孔徑條件下的系統一致性。3.5樣品制備與測量步驟樣品制備是影響TRPS測量質量的核心環節。標準從以下方面給出了具體規范：1.分散介質：推薦使用過濾后的電解質溶液（典型為含0.01%~0.1%Tween20的磷酸鹽緩沖液），以最大限度減少背景顆粒干擾；2.樣品稀釋：應根據預計顆粒濃度將樣品稀釋至每毫升約10?–10?個顆粒的水平，以避免重合事件導致的濃度低估和粒徑偏移；3.超聲分散：對于易團聚的無機納米顆粒，建議測量前采用低功率超聲浴處理1–5分鐘；4.脫氣處理：消除溶液中溶解氣泡對脈沖信號的影響；5.測量時長：建議根據顆粒濃度設定測量時長，使累計脈沖數不低于1000個，以保證粒度分布的統計代表性。3.6數據處理與結果報告標準規定了TRPS數據的計算公式、粒度分布表示方式以及結果報告的格式要求。關鍵內容包括：-粒徑-脈沖幅度校正曲線的線性回歸及不確定度傳遞計算；-基于脈沖持續時間和半寬度信息的表面電荷（ζ電位）估算方法；-粒度分布的表示方式——推薦以體積加權分布和數量加權分布兩種形式同時呈現；-結果報告需包含：測量溫度、電解質溶液組成、膜孔徑設定、校準物質信息、測量顆粒數、粒徑分布特征值（D10、D50、D90）及擴展不確定度。4標準的技術先進性與應用價值ISO13319-2:2023的發布在粒度分析標準化進程中具有里程碑式的意義，主要體現在以下幾個層面。第一，填補了納米尺度單顆粒計數標準的空白。在ISO13319-2發布前，納米顆粒的粒度分布測量尚無基于電阻脈沖原理的國際標準。DLS（ISO22412）雖可覆蓋納米粒徑范圍，但僅能提供強度加權平均粒徑及多分散信息，無法獲得準確的顆粒濃度；NTA（ISO19430）雖可提供單顆粒信息，但受限于光學衍射極限和熒光標記需求。TRPS標準提供了獨立于光學檢測原理的單顆粒電學計數方案，與現有標準形成了很好的互補。第二，建立了"粒徑-濃度-電荷"三參數同步測量的標準化范式。傳統粒度標準多聚焦于粒徑分布的測定，而ISO13319-2首次將顆粒濃度作為同等重要的輸出量納入標準規范，并對基于脈沖頻率的絕對濃度測量方法給出了系統的不確定度評定指南。這對納米藥物制劑（如脂質體、聚合物納米粒）的載藥量均一性評價、細胞外囊泡的臨床定量檢測等場景具有直接的應用價值。第三，顯著提升了復雜生物樣品測定的可靠性。細胞外囊泡、脂質體等樣品往往粒徑分布寬、顆粒濃度跨度大且易受雜質蛋白聚集體干擾。TRPS的單顆粒逐次測量原理天然免疫于小顆粒散射光的干擾，其對亞微米顆粒的高分辨區分能力使外囊泡亞群（如外泌體與微囊泡的區分）的定量分析成為可能。5科研應用與產業化前景5.1細胞外囊泡研究細胞外囊泡作為細胞間通訊的重要介質，近年來成為液體活檢和新一代藥物遞送載體的研究熱點。ISO13319-2標準為外囊泡的粒徑分布、濃度及表面電荷表征提供了標準化技術依據。在國際細胞外囊泡學會（ISEV）發布的最新指南中，TRPS已被推薦為外囊泡表征的補充方法之一。隨著標準發布，外囊泡研究的跨實驗室數據可比性將大幅提升，為臨床轉化研究奠定方法論基礎。5.2納米藥物質量評價納米藥物（如脂質體、白蛋白納米粒、聚合物膠束等）的粒徑和粒度分布直接關系到藥物的體內分布、靶向效率和安全性。各國藥典及監管機構日益重視納米藥物的粒度表征方法驗證。ISO13319-2所規定的濃度同步測量能力，為納米藥物的"批間一致性"評價提供了有力的補充手段。尤其是對于基因治療載體（如脂質納米粒LNP-mRNA疫苗），TRPS能夠在完整顆粒（裝載核酸）與空囊泡之間提供一定的區分能力，這對產品質量屬性的精細評價具有特殊價值。5.3病毒載體與疫苗分析腺相關病毒（AAV）載體的完整衣殼與空衣殼的區分是基因治療藥物生產中關鍵的質控指標之一。雖然TRPS尚不能直接區分核酸裝載量的微小差異，但其高精度的粒徑測量能力和對完整顆粒的絕對計數能力，為病毒載體制劑的聚集傾向監測和粒徑穩定性評估提供了有效工具。未來結合阻抗譜分析技術，TRPS有望實現病毒載體完整性評價的更高維度區分。5.4標準化的產業輻射ISO13319-2的發布將帶動以下產業鏈環節的標準化升級：-TRPS儀器制造商按照標準要求提升出廠校準流程和性能指標驗證方法；-制藥企業（尤其是納米藥物和基因治療領域）可將該標準作為質量研究與控制（QbD）體系中的方法學依據。6主要標準制定參與單位介紹6.1中國參與單位在中國，ISO/TC24/SC4的國內對口技術單位為全國顆粒表征與篩分及篩網標準化技術委員會（SAC/TC168），秘書處設于北京市理化分析測試中心。該委員會自TRPS標準預研階段即派遣專家參與工作組，持續跟蹤標準編制進展。北京市理化分析測試中心是北京市科學技術研究院下屬的綜合性分析測試研究機構，長期從事顆粒表征技術研發與標準物質研究。中心建有國家食品質量安全檢測重點實驗室和北京市理化分析測試中心標準物質研究所，在納米顆粒粒度標準物質研制、顆粒測量方法驗證及標準制定方面積累了豐富經驗。作為SAC/TC168的秘書處承擔單位，中心組織國內相關科研院所和企業多次召開TRPS標準研討會議，組織開展TRPS測量比對試驗，形成的技術意見有效輸出到了ISO國際標準草案中。6.2國際主要起草單位從國際層面來看，ISO13319-2的起草工作主要由以下機構深度參與：-德國聯邦材料研究與測試研究所（BAM）：作為德國標準化協會（DIN）技術委員會的核心成員，BAM在TRPS標準物質的驗證、測量不確定度評估方法方面貢獻了大量實驗數據和方法學建議。BAM研制的單分散納米顆粒標準物質在標準制定中作為參考物質使用；-英國國家物理實驗室（NPL）：NPL在納米顆粒測