CN119120645B 生牛乳中A2β-酪蛋白特征肽的檢測方法及檢測系統 （東北農業大學）

司生牛乳中A2β-酪蛋白特征肽的檢測方法及牛乳中A2β酪蛋白特征肽的檢測方法及檢測系降解監控數據進行采集，獲取實際酶解反應時2(1_1)獲取初始底物濃度和初始胰蛋白酶濃度，并從酶解反應數據庫中提取預設的參的初始底物濃度對應的酶解反應速率影響因子，⑴2表示預設的胰蛋白酶濃度對應的酶解(1_2)將酶解反應匹配指數與酶解反應數據庫中預設的各酶解反應匹配指數區間進行(2_2)將酶解反應進程偏差影響評估值與酶解反應數據庫中存儲的各酶解反應進程偏3(3_3)將預計酶解反應時間和酶解反應補償時間進行求和運算，并將求和結果標記為(3_5)將酶解反應參照指標與酶解反應數據庫中存儲的各酶解反應參照指標區間對應解過度評估指數對應的酶解反應終止判定影響從酶解反應數據庫中獲取酶解反應終止判定指標閾值，將酶解反應終酶解反應時間預估模塊，用于獲取初始底物濃度和初始胰蛋白酶濃度，酶解反應時間補償模塊，用于對酶解反應條件數據進行監測，獲取反應酶解反應效果評估模塊，用于對酶解反應的酶促轉化概況數據進行監45[0002]牛乳以其全面的營養成分被譽為自然界的完美食品，牛乳的蛋白質以酪蛋白為6[0012]將酶解反應匹配指數與酶解反應數據庫中預設的各酶解反應匹配指數區間進行[0014]將酶解反應進程偏差影響評估值與酶解反應數據庫中存儲的各酶解反應進程偏[0021]將酶解反應參照指標與酶解反應數據庫中存儲的各酶解反應參照指標區間對應7[0031](2)本發明通過綜合分析初始底物濃度和初始胰蛋白酶濃度，可以對酶解反應時免等待時間過長或過短導致的資源浪費。同時預計酶解時間有助于控制酶解反應的程度，[0032](3)本發明通過對反應環境溫度和反應環境pH值進行綜合分析，可以及時發現并[0033](4)本發明通過對底物濃度和預期產物濃度進行監測分析，可以及時了解酶解反[0034]利用附圖對本發明作進一步說明，但附圖中的實施例不構成對本發明的任何限[0037]圖3為本發明實施例涉及的酶解過度評估指數與酶解反應終止判定指標的函數關8示預設的初始底物濃度對應的酶解反應速率影響因子，⑴2表示預設的胰蛋白酶濃度對應因子的取值范圍為[0,+∞)，通過酶解反應歷史數據中初始底物濃度和胰蛋白酶濃度與酶對應的酶解反應速率影響因子和胰蛋白酶濃度對應的酶解反應速率影響9[0055]將酶解反應匹配指數與酶解反應數據庫中預設的各酶解反應匹配指數區間進行際反應條件與預設參照反應條件的偏離程度，為酶解反應需求時間的修正提供數據依據。解反應速率影響因子和環境溫度對應的酶解反應速率影響[0067]將酶解反應進程偏差影響評估值與酶解反應數據庫中存儲的各酶解反應進程偏[0076]應理解的是，本實施例中酶解不足評估指數用于量化評估酶解反應的不充分程[0086]應理解的是，本實施例中酶解過度評估指數用于量化評估酶解反應的過度程應的酶解過度評估影響因子和溶液酸價對應的酶解過度評估影響[0090]將酶解反應參照指標與酶解反應數據庫中存儲的各酶解反應參照指標區間對應酶解反應參照指標區間對應的酶解不足評估指數和酶解過度評估指數對應的酶解反應終影響因子和酶解過度評估指數對應的酶解反應終止判定影響酶解反應終止判定指標的函數關系如曲線c所示。本實施例中酶解反應終止判定指標用于定指標閾值進行比對，若酶解反應終止判定指標大于或等于酶解反應終止判定指標閾值，NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVMG試劑盒包括氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的特[0112](4)A2β酪蛋白特征肽含量計算：將步驟(2)得到的峰面積代入步驟(3)獲得的標[0115]步驟(1)中的胰蛋白酶酶解過程是利用胰蛋白酶專一作用于精氨酸(R)和賴氨酸[0118]進一步地限定，步驟(2)所述高效液相色譜的檢測條件為：硅烷基C18柱，柱長本發明進行進一步詳細說明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規方SigmaAldrich公司；碘乙酰胺(IAA)、二硫蘇糖醇(DTT)、尿素、碳酸氫銨、甲酸均購自Aladdin公司；C18脫鹽柱(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)、超濾管(賽多利斯公司，德蛋白特征肽氨基酸序列如SEQIDNO.1所示：IHPFAQTQSLVYPFPGPIPNSLPQNIPPLTQTPVVVPP[0143]分別取步驟(2)中獲得的6個不同系列濃度的特征肽標準曲線工作液100μL至2mL心15min，獲得沉淀，然后向超濾管中加入300μL緩沖液(8M尿素溶于100mMTris一HCl，pH8.5)，14000×g條件離心15min，獲得沉淀此步驟重復管中加入500μL1mg/mL胰蛋白酶溶液，37℃消化過夜；最后加入10μL10％甲酸溶液終止消[0145]利用高效液相色譜一質譜聯用技術對步驟(3)獲得的6個不同系列濃度的特征肽[0149]由步驟(4)獲得不同系列濃度的特征肽標準曲線工作液待測樣品對應的峰面積，[0150]進行線性考察，得到關于A2β一酪蛋白特征肽的線性方程，其線性方程是Y=[0152]取一定量生牛乳樣品1以5000rpm的條件進行離心脫脂，取脫脂后的奶樣100μL至境下保持30min進行烷基化；將樣品加入到超濾管中(10kDa)，并以14000×g條件離心管中加入500μL1mg/mL胰蛋白酶溶液，37℃消化過夜；最后加入10μL10％甲酸溶液終止消[0154]利用高效液相色譜一質譜聯用技術對步驟(5)獲得的待測樣品進行檢測，獲得峰后在56℃孵育還原30min，冷卻至室溫后，向離心管中添加100μL碘代乙酰胺IAA(終濃度60mM)，在室溫黑暗環境下保持30min進行烷基化14000×g條件離心15min，獲得沉淀，然后向超濾管中加入300μL緩沖液(8M尿素溶于[0163]利用高效液相色譜一質譜聯用技術對步驟(1)獲得的待測樣品進行檢測，獲得峰[0165]將步驟(2)得到的峰面積代入實施例1中步驟(4)獲得的標準曲線特征方程，得到心15min，獲得沉淀，然后向超濾管中加入300μL緩沖液(8M尿素溶于100mMTris一HCl，pH8.5)，14000×g條件離心15min，獲得沉淀此步驟重復管中加入500μL1mg/mL胰蛋白酶溶液，37℃消化過夜；最后加入10μL10％甲酸溶液終止消[0174]