NYT 4742-2025 牛輪狀病毒感染診斷技術標準立項發展報告

牛輪狀病毒感染診斷技術標準立項發展報告StandardizationDevelopmentReport:DiagnosticTechniquesforBovineRotavirusInfection摘要牛輪狀病毒（BovineRotavirus,BRV）是引起新生犢牛腹瀉最主要的病毒性病原體之一，在全球范圍內廣泛流行，每年給養牛業造成巨大的經濟損失。隨著我國畜牧養殖業向規模化、集約化方向快速發展，牛群流動性增大，牛輪狀病毒病的防控形勢日趨嚴峻，建立統一、規范、靈敏、特異的診斷技術標準已成為產業發展的迫切需求。在此背景下，中華人民共和國農業農村部于2025年4月27日發布行業標準NY/T4742-2025《牛輪狀病毒感染診斷技術》，并于2025年8月1日正式實施。本標準確立了牛輪狀病毒感染的臨床診斷、病原學檢測和血清學檢測等技術要求，系統規范了樣品采集與處理、病毒分離鑒定、反轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）、實時熒光定量RT-PCR、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、病毒中和試驗、瓊脂凝膠免疫擴散試驗等關鍵技術操作程序，并對結果判定標準作出了明確界定。本標準的發布填補了我國在牛輪狀病毒感染診斷領域農業行業標準層面的空白，為基層獸醫實驗室和各級動物疫病預防控制機構提供了統一可靠的技術依據，對提升我國牛輪狀病毒病的監測預警能力、規范診斷操作流程以及保障奶牛和肉牛養殖業持續健康發展具有重要的現實意義和應用價值。關鍵詞：牛輪狀病毒；診斷技術；行業標準；聚合酶鏈式反應；酶聯免疫吸附試驗；犢牛腹瀉AbstractBovinerotavirus(BRV)isoneofthemostimportantviralpathogenscausingdiarrheainneonatalcalves,withworldwideprevalenceandsignificanteconomiclossestothecattleindustryannually.WiththerapiddevelopmentofChina'slivestockindustrytowardlarge-scaleandintensiveproduction,theincreasingmobilityofcattleherdshasmadethepreventionandcontrolofbovinerotavirusdiseaseincreasinglychallenging.Theestablishmentofunified,standardized,sensitive,andspecificdiagnostictechnicalstandardshasbecomeanurgentdemandforindustrialdevelopment.Againstthisbackground,theMinistryofAgricultureandRuralAffairsofthePeople'sRepublicofChinaissuedtheindustrystandardNY/T4742-2025*DiagnosticTechniquesforBovineRotavirusInfection*onApril27,2025,whichwasofficiallyimplementedonAugust1,2025.Thisstandardestablishesthetechnicalrequirementsforclinicaldiagnosis,etiologicaldetection,andserologicaldetectionofbovinerotavirusinfection,systematicallystandardizingkeytechnicalproceduresincludingsamplecollectionandprocessing,virusisolationandidentification,RT-PCR,real-timefluorescentquantitativeRT-PCR,ELISA,virusneutralizationtest,andagargelimmunodiffusiontest,withclearcriteriaforresultinterpretation.TheissuanceofthisstandardfillsthegapattheagriculturalindustrystandardlevelinthefieldofbovinerotavirusinfectiondiagnosisinChina,providingunifiedandreliabletechnicalbasisforgrassrootsveterinarylaboratoriesandanimaldiseasepreventionandcontrolinstitutionsatalllevels.Ithassignificantpracticalimplicationsandapplicationvalueforenhancingthemonitoringandearlywarningcapabilitiesofbovinerotavirusdisease,standardizingdiagnosticprocedures,andensuringthesustainableandhealthydevelopmentofdairyandbeefcattleindustries.Keywords:Bovinerotavirus;Diagnostictechniques;Industrystandard;Polymerasechainreaction;Enzyme-linkedimmunosorbentassay;Calfdiarrhea1引言1.1標準編制背景牛輪狀病毒隸屬呼腸孤病毒科（*Reoviridae*）輪狀病毒屬（*Rotavirus*），為分節段的雙鏈RNA病毒，其基因組由11個RNA片段構成，編碼6種結構蛋白（VP1-VP4、VP6、VP7）和5種非結構蛋白（NSP1-NSP5）。根據VP6抗原差異，輪狀病毒可分為A-J共10個群（種），其中A群輪狀病毒是導致犢牛病毒性腹瀉最主要的病原，亦可感染人類及其他多種動物，具有重要的人獸共患公共衛生意義。該病毒自1969年首次從犢牛腹瀉糞便中被分離鑒定以來，已在全球養牛國家廣泛傳播。流行病學調查數據顯示，我國多個省份的規模化和散養牛場中牛輪狀病毒血清陽性率普遍處于較高水平，感染率可達30%～80%不等，尤其對7日齡以內的新生犢牛危害最為嚴重，致死率可達20%～50%，不僅直接造成犢牛死亡損失和生長發育受阻，還因治療成本增加、生產性能下降等因素給養殖企業帶來沉重的經濟負擔。當前，我國養牛業正處于由傳統養殖模式向標準化、規模化、智能化養殖轉型的關鍵時期，牛群交易流通頻繁，疫病跨區域傳播風險加大。然而，在NY/T4742-2025發布之前，我國尚無專門針對牛輪狀病毒感染診斷的農業行業標準或國家標準，各實驗室在實際操作中參考的技術方案來源多樣，包括國外OIE（世界動物衛生組織）推薦方法、教科書經典方案及各機構自制操作規程等。由于檢測方法不統一、操作流程不規范、結果判讀標準不一致，導致不同實驗室間的檢測結果可比性差，在一定程度上制約了牛輪狀病毒病的有效防控和凈化工作。因此，制定統一、科學的牛輪狀病毒感染診斷技術標準勢在必行。1.2標準制定必要性分析（1）產業發展的迫切需求。我國奶牛肉牛存欄量持續增長，2024年牛奶產量達到4079萬噸，肉牛出欄量穩步上升，養牛業在畜牧經濟中的比重不斷加大。牛輪狀病毒感染作為制約犢牛成活率的重要因素，其精準診斷與有效防控直接關系產業效益。（2）公共衛生安全的內在要求。輪狀病毒具有跨物種傳播的潛力，A群輪狀病毒可在人和多種動物間發生基因重配和跨種傳播。規范牛輪狀病毒的診斷技術，不僅服務于動物疫病防控，同時對評估和控制人獸共患傳播風險具有重要的公共衛生意義。（3）標準化體系建設的客觀需要。我國動物疫病診斷技術標準體系正在逐步完善，但相對于口蹄疫、牛結核病等重大動物疫病，針對牛輪狀病毒等常見多發性疫病的診斷標準尚顯不足。該標準的發布有效填補了這一空白。1.3編制依據與原則本標準的編制嚴格遵守《中華人民共和國動物防疫法》《中華人民共和國標準化法》等法律法規的要求，依據GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》進行編寫，在技術內容上充分參考了世界動物衛生組織（WOAH，原OIE）《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》中關于輪狀病毒診斷的相關技術規范，同時結合我國獸醫實驗室檢測條件的實際現狀，確保標準的科學性、先進性和可操作性。2標準主要內容2.1標準適用范圍本標準規定了牛輪狀病毒感染的臨床診斷、病原學檢測和血清學檢測的技術要求，適用于牛輪狀病毒感染的診斷、監測、檢疫以及流行病學調查等工作中對牛糞便樣品、腸道組織樣品及血清樣品中牛輪狀病毒抗原、核酸及特異性抗體的檢測。標準適用范圍明確，涵蓋了從疑似病例的臨床初診到實驗室確診的全流程檢測需求，兼顧了不同層級實驗室的技術條件和應用場景差異。2.2臨床診斷臨床診斷部分系統描述了牛輪狀病毒感染的流行病學特征和臨床表現。該病主要侵害新生犢牛，以7日齡以內的犢牛最為易感，發病急、傳播快，呈暴發性或地方流行性。典型臨床癥狀包括精神沉郁、食欲減退或廢絕、排出黃色或灰白色水樣或糊狀稀便、脫水、電解質紊亂等，嚴重者可在數小時內出現虛脫甚至死亡。流行病學特征方面，該病多發生于冬季和早春寒冷季節，衛生條件差、飼養密度大、初乳管理不當等因素均可誘發和加重疫情。臨床診斷內容為基層獸醫人員提供了基礎性的初步判斷依據，但標準同時明確指出，鑒于多種病原（如牛冠狀病毒、大腸桿菌K99、隱孢子蟲等）均可引起犢牛腹瀉且癥狀相似，僅憑臨床癥狀難以進行確定性鑒別診斷，確診須結合病原學或血清學檢測結果綜合判定，有效防范了臨床誤診的風險。2.3樣品采集與處理樣品的規范采集與前處理是保證檢測結果準確可靠的基礎環節。標準對樣品采集的時間窗口、部位、方法、數量、包裝標識及運輸保存條件均作出了明確規定：-病原學檢測樣品：以直腸糞便或肛拭子為主，宜在發病急性期（腹瀉開始后24~48小時內）采集，此時糞便中病毒含量最高，檢出率最大。糞便樣品應置于無菌密封容器中，冷藏條件下（2~8℃）應在24小時內送達實驗室，如無法及時檢測則應冷凍保存（-20℃以下），長期保存需置于-80℃或液氮中，避免反復凍融以防病毒RNA降解。-血清學檢測樣品：應無菌采集靜脈血液，分離血清后冷藏運送，保存期不超過1周時可在2~8℃條件下存放，長期保存應在-20℃以下。-組織樣品：對死亡病例，應盡快采集空腸、回腸段及腸內容物，置于含抗生素的病毒運輸液中冷藏送檢。2.4病原學檢測方法病原學檢測是確診牛輪狀病毒感染最為可靠的實驗室手段，標準涵蓋了以下三種方法。（1）病毒分離鑒定。病毒分離是牛輪狀病毒感染診斷的經典“金標準”方法，也是獲得病毒分離株進行后續分子生物學研究的基礎。標準推薦使用MA-104細胞系（非洲綠猴腎細胞）進行病毒分離培養，將處理后的糞便樣品接種細胞單層，盲傳2~3代后觀察細胞病變效應（CPE），輪狀病毒典型CPE表現為細胞圓縮、折光性增強、融合及脫落。對出現CPE的培養物，可進一步采用免疫熒光試驗（IFA）或RT-PCR方法進行病毒確認。鑒于病毒分離周期長（通常需5~14天）、對樣品質量要求高、需要專業細胞培養設施等條件限制，該方法在基礎實驗室中的應用受到一定制約，更多用于參考實驗室的確證和科研用途。（2）RT-PCR檢測方法。反轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）具有靈敏度高、特異性強、檢測快速等優點，已廣泛應用于牛輪狀病毒的常規檢測。標準中詳細規定了引物設計原則、反應體系配制、擴增程序參數及擴增產物分析鑒定方法。針對牛輪狀病毒基因組分節段且易發生變異的特點，標準推薦以高度保守的VP6基因片段作為檢測靶基因，確保方法的廣譜性和檢出率。核酸提取可采用傳統TRIzol法或商品化核酸提取試劑盒，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，根據特異性條帶的有無進行結果判定。該方法檢出限可達102～103拷貝/反應，適用于各級獸醫實驗室的日常檢測工作。（3）實時熒光定量RT-PCR方法。實時熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）在常規RT-PCR基礎上引入熒光探針（TaqMan探針法），實現了對擴增過程的實時監測和絕對定量分析。該方法不僅能夠定性檢測牛輪狀病毒核酸的存在，還可精確測定樣品中的病毒載量，為臨床病情評估、排毒動態監測、消毒效果評價等提供更為精細的數據支撐。標準在方法學上規定了標準曲線的建立方法、陽性對照與陰性對照的設置要求、擴增效率的驗證標準（90%～110%）以及Ct值的判定閾值等關鍵性能參數。該方法靈敏度較常規RT-PCR高出1~2個數量級，特異性同樣優秀，且閉管檢測大幅降低了擴增產物污染風險，在大規模流行病學調查和凈化工作中具有突出的應用前景。標準同時給出各方法性能比對數據，為不同實驗室根據自身條件選擇適宜方法提供了依據。2.5血清學檢測方法標準收錄的血清學檢測方法包括以下三種。（1）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。雙抗體夾心ELISA法用于檢測糞便樣品中的牛輪狀病毒抗原，具有操作簡便、無需特殊儀器設備、結果可肉眼判讀等優勢，非常適用于基層實驗室的批量篩查，也是目前國內外牛輪狀病毒抗原檢測應用最為廣泛的方法。間接ELISA法則用于檢測血清中特異性IgG抗體水平，適用于感染史調查和疫苗免疫效果評估。標準對ELISA試驗的包被抗體選擇、封閉條件、洗滌程序、陰陽性臨界值（OD值）計算方法等關鍵環節進行了規范，確保不同實驗室間的檢測結果具有可比性。該方法可在2~4小時內完成全部檢測流程。（2）病毒中和試驗（VNT）。病毒中和試驗是檢測牛輪狀病毒特異性中和抗體的經典方法，也是評估動物免疫保護水平的參考方法。其原理為待檢血清中的特異性中和抗體與病毒結合后，可阻斷病毒對敏感細胞（MA-104）的感染，通過觀察細胞病變的抑制情況判定抗體效價。標準詳細規定了病毒滴定、血清滅活、中和反應條件（37℃作用1小時）、細胞接種、結果判讀（以能抑制50%以上細胞病變的最高血清稀釋度作為中和抗體效價）等操作程序。該方法的不足之處在于耗時較長（需3~5天）、依賴活病毒和細胞培養體系，一般僅在有相應條件的專業實驗室中開展。（3）瓊脂凝膠免疫擴散試驗（AGID）。瓊脂凝膠免疫擴散試驗是基于抗原抗體在瓊脂凝膠中雙向擴散形成特異性沉淀線的原理建立的方法，操作簡單、無需特殊設備、成本低廉。該方法雖然靈敏度和特異性相對較低，但在資源有限的基層實驗室中仍具有應用價值，可作為輔助診斷手段使用。2.6結果判定與質量控制標準對各項檢測方法的結果判定標準給出了明確界定，并針對樣品采集、試劑保存、儀器校準、陰陽性對照設置等全流程提出了系統的質量控制要求。標準明確規定：病原學檢測中，病毒分離陽性、RT-PCR/qRT-PCR檢測陽性或ELISA抗原檢測陽性，均可判定為牛輪狀病毒感染陽性；血清學檢測中，雙份血清（急性期和恢復期）抗體滴度呈4倍及以上升高者，具有診斷意義。每批次檢測必須同時設置陽性對照、陰性對照和空白對照，以監控試驗全過程的有效性。這些規定為檢測結果的可信度提供了有力保障，也是本標準的突出亮點。3標準發布信息與實施安排NY/T4742-2025《牛輪狀病毒感染診斷技術》由中華人民共和國農業農村部于2025年4月27日以行業標準形式正式發布，編號為NY/T4742-2025，分類號為獸醫學，自2025年8月1日起在全國范圍內實施。該標準為現行有效標準，適用于全國各級動物疫病預防控制機構、獸醫實驗室、檢驗檢疫機構、科研院所及相關養殖企業。4主要起草單位介紹本標準的主要起草單位包括中國動物衛生與流行病學中心、中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所、全國畜牧總站等權威技術機構。以下重點介紹中國動物衛生與流行病學中心。中國動物衛生與流行病學中心（ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter,CAHEC）是隸屬于農業農村部的正局級事業單位，總部位于山東省青島市，是我國動物疫病防控體系中的國家級技術支撐機構。中心前身為成立于1979年的農業部動物檢疫所，經過四十余年的發展建設，現已形成涵蓋動物疫病監測預警、流行病學調查、診斷技術研發、標準制定修訂、風險評估分析等多項核心職能的綜合性技術平臺。中心設有國家外來動物疫病診斷實驗室、國家動物流行病學研究中心等國家級技術平臺，建有生物安全三級（BSL-3）實驗室、分子生物學實驗室、血清學檢測實驗室等多個功能單元，配備有高通量熒光定量PCR儀、二代基因測序儀、超速離心機等大型精密儀器設備，具備從事高致病性動物疫病和重要人獸共患病的病原分離鑒定、分子溯源和診斷技術研發的完善硬件條件。中心擁有一支以獸醫學、微生物學、分子生物學、流行病學等多學科交叉的高水平科研團隊，現有專業技術人員200余人，其中高級職稱人員占比超過40%，具有博士學位人員超過50%，形成了一批在國內動物疫病診斷領域具有重要影響力的學科帶頭人和技術骨干。在標準化工作方面，中國動物衛生與流行病學中心長期以來積極參與農業行業標準的制修訂工作，承擔全國動物衛生標準化技術委員會相關分