基于分子尺技術的RNA三維動態解析在功能不明變異解讀中的應用進展

基于分子尺技術的RNA三維動態解析在功能不明變異解讀中的應用進展【摘要】遺傳變異的功能性詮釋是精準醫學的核心議題。大量“意義未明變異(VUS)”因缺乏改變蛋白質序列的直接證據而難以確權,但可能通過重塑RNA分子的構象系綜與能量景觀而導致疾病,這一機制超出了線性轉錄組學的探測維度。本文系統闡述了一種基于非天然堿基對介導的分子尺技術。該方法通過位點特異性標記,結合脈沖電子雙共振、單分子熒光共振能量轉移和X射線散射干涉等技術,能夠在埃至納米級的空間尺度與納秒至秒級的時間尺度上精準測定RNA的構象系綜與動力學變化。本文論證了遺傳變異如何通過改變RNA的能量景觀、誘導動力學陷阱或影響翻譯速率等物理機制導致功能失調,并探討了將結構動力學數據轉化為美國醫學遺傳學與基因組學學會(ACMG)和分子病理協會(AMP)相關指南中的PS3/BS3級功能證據所面臨的挑戰。最后,本文提出了一種整合人工智能預測、高通量活細胞化學探針測定、貝葉斯統計評估與分子尺技術驗證的分級篩查策略,這一結構動力學分析范式有望為VUS的精準解讀提供物理學依據,進而作為新型功能證據支持現有指南的致病性評級,并為靶向RNA藥物的開發提供參考。【關鍵詞】意義未明變異;RNA構象動力學;分子尺;非天然堿基對;功能詮釋;精準醫學1引言意義未明變異(variantsofuncertainsignificance,VUS)指現有證據不足或存在沖突證據、無法明確分類為致病性或良性的變異類型[1]。對VUS的功能解讀亟需在序列分析的基礎上,進一步獲取由這些變異導致的RNA三維結構變化的直接證據。遺傳變異可能并不直接截短蛋白導致疾病,還可能通過擾動RNA分子的能量景觀,改變RNA構象系綜的布局分布,進而影響剪接、翻譯及分子穩定性[2-5]。然而,現有的轉錄組學技術難以捕捉埃(?)至納米(nm)尺度的動態構象變化,從而造成大量的VUS滯留于分類盲區。本綜述旨在系統闡述由非天然堿基對(unnaturalbasepair,UBP)介導的分子尺技術在VUS功能解讀中的應用范式,重點論述該技術如何通過解析RNA構象系綜與能量景觀,為解讀VUS的功能效應提供直接的結構動力學證據。2定量測量RNA三維動態的技術框架2.1UBP介導的位點特異性標記策略突破了長鏈RNA研究的瓶頸現有方法在標記長度超過200nt的RNA時面臨挑戰。化學固相合成通常僅適用于<100nt的短鏈,而酶促末端標記則通常無法高效探查分子內部的長程相互作用[6]。相比之下,基于UBP的體外轉錄系統允許將包含生物正交反應基團的非天然核苷酸定點摻入任意長度的RNA序列中,隨后通過點擊化學反應偶聯探針[7-8]。該方法已被成功用于解析從97nt短RNA到719nt病毒微基因組RNA復合物的結構域折疊[9],證實了其對于長鏈RNA研究的普適性。2.2標記策略需在位點特異性與結構擾動之間尋求平衡外源性探針的引入可能通過空間位阻或靜電效應改變局部的氫鍵網絡,進而對RNA的局部結構產生微擾[10],尤其在病毒RNA與長鏈非編碼RNA中更容易導致局部構象偏移,影響功能多效性,具體的偏移程度需視體系而定[11]。因此,在實驗設計中需引入圓二色譜或功能活性檢測以評估結構的完整性。作為互補方案,硫代磷酸酯(phosphorothioate,PS)修飾僅在磷酸骨架上引入原子級變化,對二級結構影響極其輕微。盡管在位點特異性略遜于UBP共轉錄系統,但在對結構敏感的體系中具有應用優勢[12]。2.3多維度分子尺技術可構建從單分子到系綜的結構圖譜依托特異性標記,3種核心分子尺技術能互補性地解析VUS的結構效應(表1)。脈沖電子雙共振(pulsedelectrondoubleresonance,PELDOR),亦稱雙電子-電子共振(doubleelectron-electronresonance,DEER)擅長測量1.5~16nm的長程距離分布,適用于量化VUS引起的構象異質性及不同構象態的布局比例變化[9]。單分子熒光共振能量轉移(singlemoleculeFRET,smFRET)具備高時間分辨率,能夠實時追蹤單分子水平的構象轉換速率,從而揭示VUS對折疊路徑和瞬態中間體的動力學影響[13]。X射線散射干涉(X-rayscatteringinterferometry,XSI)則利用重原子探針提供0.5~50nm的絕對距離約束,適用于測定超大分子復合物中由VUS誘導的全局拓撲結構改變[14](圖1)。3RNA構象動態失調與疾病發生的機制關聯3.1分子尺技術已具備解析復雜RNA動態行為的方法學基礎分子尺技術的可行性已在若干生物分子系統中得到了初步驗證。例如,smFRET技術已成功捕捉到黃病毒長鏈非編碼RNA在接近生理條件和Mg2+濃度依賴下的折疊中間態,并成功量化了特定堿基突變對結構穩定性的熱力學影響[7]。這項研究為基于分子尺技術的人類遺傳病相關的RNA研究提供了方法論參考。3.2蛋白編碼基因中的VUS可能通過影響翻譯動力學致病同義突變型VUS的致病機制可能不依賴蛋白序列改變,而是通過引入非最優密碼子減慢翻譯延伸速率,進而促進mRNA降解,最終導致疾病的發生[15]。若VUS誘導形成穩定的莖環結構,可能導致與RNA結合的核糖體長時間停滯,即便未觸發無前進降解(no-godecay,NGD)通路,也可能降低蛋白合成通量,導致功能性蛋白表達不足[16]。因此,分子尺技術通過構象轉變能壘變化的定量,有望為區分僅影響翻譯效率的RNA高級結構及無顯著功能影響的同義突變提供一組物理化學參數。3.3RNA構象系綜的偏移為RNA相關遺傳病提供了直接病理證據RNA分子結構動力學的改變可能是多種遺傳病的分子機制之一。這種構象平衡的偏移可能影響RNA的剪接調控。例如,在脊髓性肌萎縮癥(spinalmuscularatrophy,SMA)中,小分子藥物利司撲蘭(Risdiplam)能夠通過穩定SMN2前體mRNA剪接調控區的特定功能構象,促進第7外顯子的正確納入[17]。類似地,研究者在與神經發育障礙相關的剪接體U4和U5snRNA基因中,觀察到新發(denovo)變異傾向于聚集在莖環、假結等結構域,推測其可能通過干擾U4/U6或U5的精確相互作用而影響5'剪接位點的識別與外顯子對齊,從而揭示了非編碼snRNA動態失調的一種潛在的致病機制[18]。除影響剪接過程外,構象動力學的改變亦可能直接調控RNA的生物學活性。在先天性角化不良(dyskeratosiscongenita)中,除由PARN基因內含子變異導致的外顯子跳躍和無義介導的mRNA降解路徑外[19],smFRET針對人端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)的分析顯示,hTR假結區一個2nt的非互補突變雖未導致RNA降解,但顯著降低了假結區的折疊速率常數,導致構象平衡向非功能性的發夾結構偏移,這也許能夠解釋其破壞端粒酶活性的機理[20]。異常的RNA構象還可能通過改變與蛋白質的相互作用而致病。在強直性肌營養不良1型(myotonicdystrophytype1)中,DMPK基因3'非翻譯區的CUG重復序列異常擴展,形成具有毒性的RNA發夾結構,成為動態構象陷阱,隔離MBNL1等剪接因子,繼而導致下游的剪接異常[21]。上述案例表明,VUS的致病性可能并不總是體現在靜態結構的完全破壞,而是構象系綜中不同功能狀態之間平衡常數或動力學速率常數的改變上。4結論與展望由分子尺技術獲得的構象系綜布局比例、折疊/展開速率常數等構象系綜參數,可以分別從埃至納米級的空間尺度與納秒至秒級的時間尺度直接捕捉RNA在溶液狀態下的隱藏構象狀態與瞬態能量景觀[6-7,15]。對于這類動態構象信息的獲取,將為揭示VUS導致功能失調的機制提供結構動力學維度的證據支持[2,11]。因此,由分子尺技術獲得的構象系綜參數有望作為一種新型功能證據,為完善現有美國醫學遺傳學與基因組學學會(AmericanCollegeofMedicalGeneticsandGenomics,ACMG)和分子病理協會(AssociationforMolecularPathology,AMP)指南中VUS的功能性評級提供參考。然而,將分子尺技術獲得的數據向臨床標準證據轉化仍面臨一定的挑戰。首先,體外功能實驗的結果不能直接被用于臨床評級。根據臨床基因組資源(ClinicalGenomeResource,ClinGen)推薦的序列變異解讀框架,體外功能實驗的結果需要被轉換為致病性的可能概率(oddsofpathogenicity,OddsPath)[22]。其次,RNA分子具有功能異質性,而非編碼區目前仍缺乏已確立的已知致病與良性變異(well-establishedknownpathogenicandbenignvariants)作為統計校準的參考集。這就意味著難以將獲得的物理化學參數用于判定變異的致病性[4-5]。針對這一問題,未來的研究可以嘗試借鑒藥理學中的劑量與效應曲線原理,構建構象物理參數與下游生化反應及細胞表型的定量關聯曲線[15-16],探討微觀構象布局傾向的能量變化與細胞生理活性指標受損程度之間的映射關系,進而推導出RNA分子功能異常的物理參數的臨界值[23]。此外,分子尺技術本身也存在應用的限制。該技術對樣品制備要求嚴格、檢測周期較長、并且依賴EPR波譜儀和單分子熒光顯微鏡等專業設備。由于單一的分子尺技術難以滿足臨床轉化的需求,采用計算生物學預測、高通量生化實驗與單分子精密測量相結合的分級篩查策略可能是分子尺技術臨床轉化的一條可行路徑[24-25]。該策略可首先利用整合了大規模數據集的RiNALMo、NuFold等RNA人工智能算法模型對VUS進行計算評估,篩選出具有較高三維結構改變風險的候選變異,并將預測評分作為計算與預測輔助證據(computationalandpredictiveevidence,PP3)[26-27]。隨后,針對參考集相對匱乏的困境,可以引入多重變異效應分析(multiplexedassaysofvarianteffects,MAVEs)框架[28],高通量評估變異的功能影響。該方法在構建包含突變的質粒文庫時,需要將研究靶標或同源結構域中已明確臨床分類的致病與良性變異作為內部基準預先摻入文庫中[29]。之后,再將該突變質粒文庫轉染至宿主細胞,并在活細胞中運用細胞內選擇性羥基酰化分析結合突變圖譜(in-cellselective2'-hydroxylacylationanalyzedbyprimerextensionandmutationalprofiling,In-cellSHAPE-MaP)或硫酸二甲酯結合突變圖譜測序(dimethylsulfatemutationalprofilingwithsequencing,DMS-MaPseq)為代表的高通量生化探針技術,在同一實驗體系內平行繪制文庫中變異的局部構象柔性變化圖譜[30-32]。在獲取這類生化探測數據后,需要將其轉化為OddsPath。由于生化探針獲取的突變效應圖譜表現為連續的數值,研究者可使用貝葉斯統計校準模型,依據上述的預先摻入文庫的基準數據分布特征,將測定的VUS的生化數值轉換為OddsPath,從而完成對VUS所處RNA結構域突變耐受度的定量定標[3,33]。最后,對于在高通量生化探測中得分處于臨界值附近或涉及關鍵藥物靶點的VUS,利用分子尺技術在體外進行結構動力學參數的精準測定,可望與原位探測的結果形成相互印證的跨尺度證據[9,12,20,33]。在多維數據整合階段,可以通過評估細胞內生化網絡對突變能量損失的代償能力,為準確判斷變異的真實致病性提供關鍵參考[3,33]。若體外測得VUS從非活性構象向活性構象轉變所需的能量超過了細胞內相關核糖核酸結合蛋白(RNA-bindingproteins,RBPs)網絡所能夠提供的結合自由能代償的上限,則可以在一定程度上推斷細胞難以通過誘導契合機制糾正該突變造成的構象擾動,從而提高多維數據整合預測體內真實構象狀態的可靠性。綜上所述,以分子尺技術的三維動態解析為核心、整合了計算模型預篩、高通量活細胞化學探針測定、貝葉斯統計評估的結構動力學分析范式,可能有助于在一定程度上填補基因型與表型之間的認知空白,為VUS的精準解讀提供客觀的物理依據,有望作為新型功能證據支持ACMG/AMP指南的致病性評級,并為靶向RNA的藥物開發提供參考。參考文獻[1]RichardsS,AzizN,BaleS,etal.Standardsandguidelinesfortheinterpretationofsequencevariants:AjointconsensusrecommendationoftheAmericanCollegeofMedicalGeneticsandGenomicsandtheAssociationforMolecularPathology[J].GenetMed,2015,17(5):405-424.DOI:10.1038/gim.2015.30.[2]GanserLR,KellyML,HerschlagD,etal.TherolesofstructuraldynamicsinthecellularfunctionsofRNAs[J].NatRevMolCellBiol,2019,20(8):474-489.DOI:10.1038/s41580-019-0136-0.[3]TsaiCJ,NussinovR.Aunifiedviewof"howallosteryworks"[J].PLoSComputBiol,2014,10(2):e1003394.DOI:10.1371/journal.pcbi.1003394.[4]SoemediR,CyganKJ,RhineCL,etal.Pathogenicvariantsthatalterproteincodeoftendisruptsplicing[J].NatGenet,2017,49(6):848-855.DOI:10.1038/ng.3837.[5]KremerLS,BaderDM,MertesC,etal.GeneticdiagnosisofMendeliandisordersviaRNAsequencing[J].NatCommun,2017,8(1):15824.DOI:10.1038/ncomms15824.[6]ShiX,BonillaS,HerschlagD,etal.QuantifyingnucleicacidensembleswithX-rayscatteringinterferometry[J].MethodsEnzymol,2015,558:75-97.DOI:10.1016/bs.mie.2015.02.001.[7]ZhangJ,FangX.EmpoweringthemolecularrulertechniqueswithunnaturalbasepairsystemtoexploreconformationaldynamicsofflaviviralRNAs[J].CurrOpinStructBiol,2024,89:102944.DOI:10.1016/j.sbi.2024.102944.[8]WangY,KathiresanV,ChenY,etal.Posttranscriptionalsite-directedspinlabelingoflargeRNAswithanunnaturalbasepairsystemundernon-denaturingconditions[J].ChemSci,2020,11(35):9655-9664.DOI:10.1039/d0sc01717e.[9]WangY,ChenY,HuY,etal.Site-specificcovalentlabelingoflargeRNAswithnanoparticlesempoweredbyexpandedgeneticalphabettranscription[J].ProcNatlAcadSciUSA,2020,117(37):22823-22832.DOI:10.1073/pnas.2005217117.[10]PitonN,MuY,StockG,etal.Base-specificspin-labelingofRNAforstructuredetermination[J].NucleicAcidsRes,2007,35(9):3128-3143.DOI:10.1093/nar/gkm169.[11]LeeYT.NexusbetweenRNAconformationaldynamicsandfunctionalversatility[J].CurrOpinStructBiol,2024,89:102942.DOI:10.1016/j.sbi.2024.102942.[12]HuY,WangY,SinghJ,etal.Phosphorothioate-basedsite-specificlabelingoflargeRNAsforstructuralanddynamicstudies[J].ACSChemBiol,2022,17(9):2448-2460.DOI:10.1021/acschembio.2c00199.[13]LernerE,CordesT,IngargiolaA,etal.Towarddynamicstructuralbiology:Twodecadesofsingle-moleculeF?rsterresonanceenergytransfer[J].Science,2018,359(6373):eaan1133.DOI:10.1126/science.aan1133.[14]LeeS,KiH,LeeSJ,etal.Single-moleculeX-rayscatteringusedtovisualizetheconformationdistributionofbiologicalmoleculesviasingle-objectscatteringsampling[J].IntJMolSci,2023,24(24):17135.DOI:10.3390/ijms242417135.[15]PresnyakV,AlhusainiN,ChenYH,etal.CodonoptimalityisamajordeterminantofmRNAstability[J].Cell,2015,160(6):1111-1124.DOI:10.1016/j.cell.2015.02.029.[16]VeltriAJ,D′OrazioKN,LessenLN,etal.DistinctelongationstallsduringtranslationarelinkedwithdistinctpathwaysformRNAdegradation[J].Elife,2022,11:e76038.DOI:10.7554/eLife.76038.[17]CampagneS,BoignerS,RüdisserS,etal.StructuralbasisofasmallmoleculetargetingRNAforaspecificsplicingcorrection[J].NatChemBiol,2019,15(12):1191-1198.DOI:10.1038/s41589-019-0384-5.[18]NavaC,CogneB,SantiniA,etal.DominantvariantsinmajorspliceosomeU4andU5smallnuclearRNAgenescauseneurodevelopmentaldisordersthroughsplicingdisruption[J].NatGenet,2025,57(6):1374-1388.DOI:10.1038/s41588-025-02184-4.[19]AkimovaD,SemenovaN,CherevatovaT,etal.RNAanalysisuncoverspathogenicPARNvariantindyskeratosiscongenita[J].ClinGenet,2026,109(2):346-351.DOI:10.1111/cge.70037.[20]HolmstromED,NesbittDJ.Single-moleculefluorescenceresonanceenergytransferstudiesofthehumantelomeraseRNApseudoknot:Temperature-/Urea-dependentfoldingkineticsandthermodynamics[J].JPhysChemB,2014,118(14):3853-3863.DOI:10.1021/jp501893c.[21]WangKW,RiverosI,DeLoyeJ,etal.DynamicdockingofsmallmoleculestargetingRNACUGrepeatscausingmyotonicdystrophytype1[J].BiophysJ,2023,122(1):180-196.DOI:10.1016/j.bpj.2022.11.010.[22]BrnichSE,AbouTayounAN,CouchFJ,etal.RecommendationsforapplicationofthefunctionalevidencePS3/BS3criterionusingtheACMG/AMPsequencevariantinterpretationframework[J].GenomeMed,2019,12(1):3.DOI:10.1186/s13073-019-0690-2.[23]StelzerAC,FrankAT,KratzJD,etal.DiscoveryofselectivebioactivesmallmoleculesbytargetinganRNAdynamicensemble[J].NatChemBiol,2011,7(8):553-559.DOI:10.1038/nchembio.596.[24]MuK,FeiY,XuY,etal.RASPv2.0:anupdatedatlasforRNAstructureprobingdata[J].NucleicAcidsRes,2025,53(D1):D211-D219.DOI:10.1093/nar/gkae1117.[25]BustamanteA,CarrocciTJ,NicholsonDA,etal.NascentRNAfoldingandRNPassemblyrevealedbysingle-moleculemicroscopy[J].JMolBiol,2026,438(1):169365.DOI:10.1016/j.jmb.2025.169365.[26]Peni?RJ,Vla?i?T,HuberRG,etal.RiNALMo:General-purposeRNAlanguagemodelscangeneralizewellonstructurepredictiontasks[J].NatCommun,2025,16(1):5671.DOI:10.1038/s41467-025-60872-5.[27]KagayaY,ZhangZ,IbtehazN,etal.NuFold:End-to-endapproachforRNAtertiarystructurepredictionwithflexiblenucleobasecenterrepresentation[J].NatCommun,2025,16(1):881.DOI:10.1038/s41467-025-56261-7.[28]WeileJ,RothFP.Multipl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