ISOTS 244202023 生物技術(shù).大規(guī)模平行DNA測序.鳥槍宏基因組序列數(shù)據(jù)處理的一般要求標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)發(fā)展報(bào)告

標(biāo)題：生物技術(shù).大規(guī)模平行DNA測序.鳥槍宏基因組序列數(shù)據(jù)處理的一般要求標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)發(fā)展報(bào)告EnglishTitle:StandardizationDevelopmentReport:Biotechnology—MassivelyparallelDNAsequencing—Generalrequirementsfordataprocessingofshotgunmetagenomicsequences摘要隨著高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，大規(guī)模平行DNA測序已成為生命科學(xué)研究的核心工具，尤其在宏基因組學(xué)領(lǐng)域，鳥槍宏基因組測序技術(shù)能夠無偏倚地揭示復(fù)雜微生物群落的物種組成與功能潛力。然而，海量原始測序數(shù)據(jù)的處理過程缺乏統(tǒng)一規(guī)范，導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)室、不同平臺(tái)產(chǎn)出的結(jié)果在準(zhǔn)確性、可比性和可重復(fù)性方面存在顯著差異，嚴(yán)重制約了該技術(shù)在臨床診斷、公共衛(wèi)生監(jiān)測及環(huán)境治理等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。在此背景下，國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）發(fā)布了ISO/TS24420:2023標(biāo)準(zhǔn)，旨在為鳥槍宏基因組序列數(shù)據(jù)處理提供一套通用的技術(shù)要求和規(guī)范框架。本報(bào)告全面闡述了該標(biāo)準(zhǔn)的立項(xiàng)背景、核心內(nèi)容、技術(shù)價(jià)值及產(chǎn)業(yè)影響。報(bào)告指出，該標(biāo)準(zhǔn)開創(chuàng)性地定義了從數(shù)據(jù)質(zhì)量控制、宿主DNA去除、序列組裝、物種分類注釋到功能分析等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的通用要求，為全球生物技術(shù)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)協(xié)同奠定了基石。本報(bào)告旨在為相關(guān)機(jī)構(gòu)、研發(fā)人員及行業(yè)管理者深入理解該國際標(biāo)準(zhǔn)提供權(quán)威參考，并展望其在精準(zhǔn)醫(yī)療、農(nóng)業(yè)微生物組、生物安全等領(lǐng)域的應(yīng)用前景，呼吁國內(nèi)相關(guān)行業(yè)積極采標(biāo)并開展配套標(biāo)準(zhǔn)體系建設(shè)。關(guān)鍵詞生物技術(shù)；大規(guī)模平行測序；鳥槍宏基因組；數(shù)據(jù)處理；ISO標(biāo)準(zhǔn)；通用要求；生物信息學(xué)；標(biāo)準(zhǔn)化Keywords:Biotechnology;MassivelyParallelSequencing;ShotgunMetagenomics;DataProcessing;ISOStandard;GeneralRequirements;Bioinformatics;Standardization正文一、引言與背景生物技術(shù)作為21世紀(jì)最具變革性的技術(shù)領(lǐng)域之一，正以前所未有的速度重塑著醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保及能源等多個(gè)產(chǎn)業(yè)格局。其中，基于大規(guī)模平行DNA測序（MassivelyParallelDNASequencing,MPS）的宏基因組學(xué)技術(shù)，特別是鳥槍宏基因組測序，因其無需預(yù)擴(kuò)增特定基因、能全面捕捉樣本中所有微生物（包括細(xì)菌、古菌、真菌、病毒）的遺傳信息而成為研究復(fù)雜微生物群落“黑箱”的金鑰匙。該技術(shù)的應(yīng)用，從人體腸道微生物與疾病的關(guān)系，到土壤微生物對作物健康的影響，再到海洋微生物在碳循環(huán)中的作用，展現(xiàn)出了巨大的潛力。然而，技術(shù)的爆發(fā)式發(fā)展也帶來了新的挑戰(zhàn)。一個(gè)典型的鳥槍宏基因組測序項(xiàng)目產(chǎn)出數(shù)據(jù)量可達(dá)數(shù)十至上百Gb，其數(shù)據(jù)分析流程涉及多個(gè)復(fù)雜的計(jì)算步驟，包括原始讀段質(zhì)量控制、低質(zhì)量或污染序列剔除、宿主基因組序列的映射濾除、宏基因組從頭組裝、基因預(yù)測與功能注釋、物種分類與相對豐度估算等。目前，全球范圍內(nèi)存在數(shù)百種不同的生物信息學(xué)軟件和流程，且不同流程在算法選擇、參數(shù)設(shè)定、數(shù)據(jù)庫版本上差異顯著。這種“巴別塔”現(xiàn)象導(dǎo)致的結(jié)果是：對同一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化參考樣本進(jìn)行測序分析，不同實(shí)驗(yàn)室可能得出截然不同的結(jié)論。這一問題的存在，嚴(yán)重阻礙了宏基因組學(xué)研究成果的互認(rèn)、跨平臺(tái)的整合分析以及相關(guān)技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化落地。在此關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，國際標(biāo)準(zhǔn)化組織生物技術(shù)技術(shù)委員會(huì)（ISO/TC276）敏銳地捕捉到了行業(yè)痛點(diǎn)，啟動(dòng)了ISO/TS24420標(biāo)準(zhǔn)的制定工作。該標(biāo)準(zhǔn)于2023年5月正式發(fā)布，旨在為鳥槍宏基因組測序數(shù)據(jù)的處理提供一個(gè)“通用語言”和“操作框架”，解決當(dāng)前數(shù)據(jù)分析領(lǐng)域的碎片化、不可重復(fù)性問題。本報(bào)告將深入剖析該標(biāo)準(zhǔn)的核心要點(diǎn)，評估其技術(shù)價(jià)值，并探討其對未來生物技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的引領(lǐng)作用。二、標(biāo)準(zhǔn)的核心內(nèi)容與技術(shù)解析ISO/TS24420:2023屬于技術(shù)規(guī)范（TechnicalSpecification,TS）級別，而非正式國際標(biāo)準(zhǔn)（IS），這反映了該領(lǐng)域技術(shù)迭代速度之快，采用TS形式可更快地為市場提供指導(dǎo)，同時(shí)為未來升級為正式標(biāo)準(zhǔn)積累經(jīng)驗(yàn)。該標(biāo)準(zhǔn)的核心框架圍繞“通用要求”展開，而非規(guī)定某一種特定的算法或軟件。它定義了處理鳥槍宏基因組序列數(shù)據(jù)時(shí)，任何流程都應(yīng)滿足或遵循的原則性要求。其主要技術(shù)內(nèi)容涵蓋以下幾個(gè)方面：1.數(shù)據(jù)輸入與質(zhì)量控制（DataInputandQualityControl）-原始數(shù)據(jù)格式：要求測序平臺(tái)產(chǎn)出的原始數(shù)據(jù)（通常是FASTQ格式）應(yīng)包含正確的堿基質(zhì)量評分，并明確記錄測序平臺(tái)、讀長、測序模式（單端/雙端）等元數(shù)據(jù)。-預(yù)處理要求：定義了通用的質(zhì)量控制指標(biāo)，如堿基質(zhì)量閾值（Phredscore）、讀段長度分布、GC含量、接頭污染及重復(fù)讀段比等。要求流程必須明確其剔除低質(zhì)量數(shù)據(jù)、過濾人源（或其他宿主）讀段的具體方法和閾值，并報(bào)告每一步過濾后的數(shù)據(jù)保留率。這確保了后續(xù)分析的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)是可靠且一致的。2.宿主DNA去除與污染控制（HostDNARemovalandContaminationControl）-映射方法：對于涉及人體或其他復(fù)雜宿主的樣本，標(biāo)準(zhǔn)要求必須進(jìn)行宿主DNA序列的去除。它推薦使用精確映射工具將讀段映射到參考宿主基因組，并明確界定映射的嚴(yán)格程度（如允許的錯(cuò)配數(shù)）。對于無參考基因組的宿主，則應(yīng)提出替代方案，如基于k-mer頻率的區(qū)分方法。-污染識別與報(bào)告：要求流程能夠識別并報(bào)告可能來自實(shí)驗(yàn)試劑、環(huán)境或交叉污染的外源序列。鼓勵(lì)使用陰性對照和陽性對照來評估污染水平，并在最終結(jié)果中標(biāo)注潛在的污染風(fēng)險(xiǎn)。3.序列組裝與分箱（SequenceAssemblyandBinning）-組裝策略：標(biāo)準(zhǔn)承認(rèn)有參組裝和無參組裝兩種路徑，并分別提出了要求。對于無參組裝，強(qiáng)調(diào)需說明使用的組裝軟件、k-mer參數(shù)設(shè)置，以及評估組裝質(zhì)量的指標(biāo)（如N50、組裝后的最大重疊群長度、總組裝長度等）。4.物種分類與功能注釋（TaxonomicClassificationandFunctionalAnnotation）-分類方法：要求明確采用基于序列相似性（如BLAST、Kraken2）、組成型方法或混合方法。必須注明所使用的參考數(shù)據(jù)庫（如NCBIRefSeq、GTDB）及其版本、發(fā)布時(shí)間和構(gòu)建方法。標(biāo)準(zhǔn)建議使用多種獨(dú)立的方法進(jìn)行交叉驗(yàn)證，并報(bào)告未分類序列的比例。-功能注釋：要求對預(yù)測基因或組裝后的重疊群進(jìn)行功能注釋。需注明使用的與功能相關(guān)的數(shù)據(jù)庫（如KEGG、COG、Pfam、CAZy、CARD等）的版本，以及用于基因預(yù)測和功能分配的閾值（如e-value、覆蓋度）。鼓勵(lì)進(jìn)行通路富集分析，以將功能變化與樣本表型或環(huán)境條件相關(guān)聯(lián)。5.數(shù)據(jù)記錄、報(bào)告與可重復(fù)性（DataRecording,Reporting,andReproducibility）-元數(shù)據(jù)記錄：這是一個(gè)貫穿始終的核心要求。標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)制要求記錄分析環(huán)境的完整信息，包括：使用的操作系統(tǒng)、所有軟件工具的名稱與精確版本號（而非“最新版”）、所有的核心參數(shù)設(shè)置、計(jì)算資源（CPU、內(nèi)存、磁盤）以及最終的參考數(shù)據(jù)庫版本和下載路徑。-結(jié)果報(bào)告：報(bào)告應(yīng)包含一個(gè)清晰的“數(shù)據(jù)分析工作流”圖或邏輯步驟說明。結(jié)果中應(yīng)涵蓋所有關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)（如污染率、組裝質(zhì)量、未分類比例等），并確保原始數(shù)據(jù)、分析腳本和關(guān)鍵中間文件（如質(zhì)量控制后的數(shù)據(jù)、組裝結(jié)果）符合FAIR原則（可發(fā)現(xiàn)、可訪問、可互操作、可重用）。三、主要參與單位及委員會(huì)介紹：ISO/TC276生物技術(shù)技術(shù)委員會(huì)ISO/TS24420:2023的誕生離不開其背后的核心推動(dòng)力量——ISO/TC276（生物技術(shù)技術(shù)委員會(huì)）。該技術(shù)委員會(huì)于2013年由國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）技術(shù)管理局（TMB）批準(zhǔn)成立，秘書處由中國與德國共同承擔(dān)，其中中國承擔(dān)的是主席國職務(wù)，德國承擔(dān)的是秘書處工作。這一合作模式本身就體現(xiàn)了生物技術(shù)領(lǐng)域全球協(xié)同的特點(diǎn)。ISO/TC276的宗旨與工作范圍ISO/TC276的主要職責(zé)是制定生物技術(shù)領(lǐng)域的產(chǎn)品、材料、過程、分析方法及用于數(shù)據(jù)管理和發(fā)布的術(shù)語、定義、規(guī)范及技術(shù)要求等方面的國際標(biāo)準(zhǔn)。其工作范圍覆蓋了從基礎(chǔ)研究到產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的全鏈條，具體包括：-通用方面：術(shù)語、生物數(shù)據(jù)與信息學(xué)標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)量管理與性能評估。-生物制品：細(xì)胞和基因療法產(chǎn)品、生物過程工程中的原材料、中間體及最終產(chǎn)品的規(guī)范。-分析工具：用于生物制品的表征、質(zhì)量控制及檢測的分析方法，如核酸測序、基因組編輯、蛋白質(zhì)分析等。-生物資源中心：關(guān)于微生物、細(xì)胞系、組織等生物材料的管理、保藏、交換和認(rèn)證的標(biāo)準(zhǔn)。-新興領(lǐng)域：合成生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、工業(yè)生物技術(shù)等前沿領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)研與制定。ISO/TC276的組織結(jié)構(gòu)與成員該委員會(huì)下設(shè)多個(gè)工作組（WG）和項(xiàng)目組（PG），每個(gè)組專注于特定的技術(shù)主題。例如，負(fù)責(zé)ISO/TS24420制定工作的很可能是專注于“生物信息學(xué)與數(shù)據(jù)管理”或“測序與分析”的工作組。其成員由來自全球各國的專家、標(biāo)準(zhǔn)化機(jī)構(gòu)代表、行業(yè)協(xié)會(huì)、科研機(jī)構(gòu)及大型生物技術(shù)公司的代表組成。中國的專家團(tuán)隊(duì)在該委員會(huì)中一直扮演著積極且重要的角色，多次主導(dǎo)或深度參與了多項(xiàng)關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)的制定，將中國在宏基因組學(xué)研究領(lǐng)域的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和產(chǎn)業(yè)需求融入國際標(biāo)準(zhǔn)，體現(xiàn)了中國在生物技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)領(lǐng)域的國際話語權(quán)。對標(biāo)準(zhǔn)制定的貢獻(xiàn)與影響ISO/TC276通過其嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶＜覍彶椤f(xié)商一致的決策機(jī)制，確保了ISO/TS24420的科學(xué)性與普適性。委員會(huì)組織多次國際專家會(huì)議和投票，廣泛聽取了來自學(xué)術(shù)界（如人類微生物組計(jì)劃、地球微生物組計(jì)劃）和工業(yè)界（如測序儀制造商、生物信息學(xué)工具開發(fā)商、第三方診斷機(jī)構(gòu)）的意見。特別是，該標(biāo)準(zhǔn)在處理“宿主去除”和“MAGs”等關(guān)鍵技術(shù)難點(diǎn)上，平衡了學(xué)術(shù)界的先進(jìn)性與工業(yè)界的實(shí)用性。正是由于ISO/TC276的權(quán)威領(lǐng)導(dǎo)和專業(yè)組織，ISO/TS24420才得以成功發(fā)布，為全球生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程樹立了一個(gè)重要里程碑。四、標(biāo)準(zhǔn)的意義、應(yīng)用與展望標(biāo)準(zhǔn)的意義1.建立互信與互認(rèn)可：ISO/TS24420為不同實(shí)驗(yàn)室、不同測序平臺(tái)產(chǎn)生的宏基因組數(shù)據(jù)提供了一套通用的處理語言和評估尺度。當(dāng)所有實(shí)驗(yàn)室都遵循相同的質(zhì)量控制要求、組裝評估標(biāo)準(zhǔn)和注釋數(shù)據(jù)庫版本時(shí)，即使在具體流程上存在差異，但最終結(jié)果的科學(xué)意義和可信度將大大提高，極大促進(jìn)跨研究項(xiàng)目、跨國家的數(shù)據(jù)整合與分析。2.加速臨床轉(zhuǎn)化與監(jiān)管：在臨床微生物組診斷、傳染病溯源、耐藥基因檢測等領(lǐng)域，數(shù)據(jù)處理的標(biāo)準(zhǔn)化是獲得監(jiān)管機(jī)構(gòu)（如美國FDA、中國NMPA）認(rèn)可的關(guān)鍵前提。該標(biāo)準(zhǔn)為診斷試劑盒的軟件算法性能驗(yàn)證提供了基準(zhǔn)，為監(jiān)管部門評估產(chǎn)品的可靠性和有效性提供了依據(jù)，從而加速了宏基因組技術(shù)從科研工具向臨床IVD產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化進(jìn)程。3.賦能工業(yè)與產(chǎn)業(yè)應(yīng)用：在農(nóng)業(yè)微生物組肥料開發(fā)、環(huán)境生物修復(fù)、食品微生物監(jiān)控等工業(yè)場景中，標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)處理流程能確保產(chǎn)品的質(zhì)量控制和批次間一致性。企業(yè)可以依據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)制定內(nèi)部SOP，提升產(chǎn)品開發(fā)效率，降低因數(shù)據(jù)分析不一致導(dǎo)致的研發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，并以此作為與客戶、合作伙伴及監(jiān)管機(jī)構(gòu)溝通的共同語言。應(yīng)用場景展望-公共衛(wèi)生與傳染病防控：利用標(biāo)準(zhǔn)化的流程從污水或呼吸道樣本宏基因組數(shù)據(jù)中快速、準(zhǔn)確地識別病原微生物，并對變異株進(jìn)行追蹤，將成為全球疫情監(jiān)測的常態(tài)化手段。-個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療：將腸道菌群的宏基因組分析與宿主基因組、代謝組信息結(jié)合，要求在數(shù)據(jù)處理層面實(shí)現(xiàn)深度標(biāo)準(zhǔn)化，以確保對疾病的預(yù)測、診斷及療效評估的可靠性。ISO/TS24420為此提供了底層數(shù)據(jù)處理的規(guī)范基礎(chǔ)。-農(nóng)業(yè)與食品安全：在篩選具有促生或抗病功能的作物根際微生物時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)化流程能確保篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性，加速高效微生物菌劑的開發(fā)。在食品供應(yīng)鏈中，對食源性病原體的宏基因組篩查也將因數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化而得到更廣泛的部署。未來展望ISO/TS24420作為一項(xiàng)技術(shù)規(guī)范，其生命周期天然具有迭代性。未來，該標(biāo)準(zhǔn)可能向以下幾個(gè)方面演進(jìn)：1.升級為正式國際標(biāo)準(zhǔn)（IS）：隨著技術(shù)的成熟和更廣泛的采納，當(dāng)前的TS很可能在若干年后升級為正式的ISO標(biāo)準(zhǔn)，具有更強(qiáng)的約束力。2.增加具體場景的規(guī)范性