CN116179593B 絞股藍毛狀根遺傳轉化體系的建立方法 （廣西中醫藥大學）_第1頁
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A,2023.06.06A,2023.10.10A,2024.02.20A,2023.05.30gypenosidebiosynthesis.BBiology.2024,第24卷1-14.本發明公開了一種絞股藍毛狀根遺傳轉化共培養過程中產生菌斑的外植體用含有抑菌劑含有篩選抗生素的6,7-V固體篩選培養基培養，為絞股藍的基因功能研究及利用生物技術手段提高絞股藍藥效活性成分的含量提供了技術支2素的LB液體培養基中，28～30℃,180～220r/min振蕩培養至菌液濃度達到OD＝0.8-3[0002]絞股藍Gynostemmapentaphyllum(Thunb.)Makino為葫蘆科絞股藍屬草質攀援植合成與調控方面具有獨特的優勢。例如利用在人參毛狀根中過表達法尼基焦磷酸合酶[0008]2)發根農桿菌侵染液的制備：將含有目的基因的表達載體質粒轉化至發根農桿4[0015]優選的是，步驟1)中，在無菌絞股藍葉片上[0018]b)在無菌操作臺中，用接種環挑取步驟a)轉化后的發根農桿菌，劃線到含40~[0020]d)按照0.8％-1％的接種量，取步驟c)培養的[0021]e)步驟d)培養的菌液在8000r/min離心5min后倒掉上清液收集菌體；MS液體培養5[0052]選擇發根農根菌MSU440(鏈霉素抗性)、發根農根菌Ar.Qual(鏈霉素和氯霉素抗6[0065]將在共培養過程中形成菌斑的外植體用無菌水(含有300～400mg/L羧芐青霉素和漸的降低抗生素的濃度直至外植體周圍的菌斑完[0069]侵染后培養20d統計不同發根農桿菌侵染葉片和莖段誘導的發根數，根據毛狀根采用絞股藍的莖段作為外植體誘導發根的概率極低，5個發根農桿菌菌株均能誘導出發根7[0079](一)以絞股藍基因組中轉錄因子GpbHLH4的CDS序列為參照設計特異引物[0085]通過兩輪PCR反應將attB位點添加到GpbHLH4的CDS序列兩側，使片段兩端帶上83'。[0092]將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳并回收大小約為1200bp的目的條帶。于冰上配制[0097]利用Gateway技術的同源重組方式將GpbHLH4的CDS序列組裝到pK7WG2D過表達載體上(載體圖普如圖3所示)。于冰上配制LR重組反應體系：含目的片段的中間載體2O成功得到含目的基因的表達載體質粒pK7WG29[0107]步驟三、挑取單個菌落，接種到1.5mLLB液體培養基中(含50mg/L壯觀霉素)，[0116]將在共培養過程中形成菌斑的外植體用無菌水(含有300～400mg/L羧芐青霉素和[0125]PCR檢測結果表明：3個誘導發根系中均能夠檢測到rolB和rolC基因，效率為子碰撞能量6eV，碎片離子碰撞能量20～50eV，質量掃描范圍m/z100～2000，掃描時間[0133]采用正離子多反應監測(MRM)定量模式，將對照品和總皂苷樣品溶液進行定性分達GpbHLH4的根系中絞股藍皂苷合成路徑關鍵酶基因的表達水平顯著提高。同時，過表達

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