（正式版）DB65∕T 4669-2023 《小反芻獸疫病毒與羊傳染性膿皰病毒雙重實時熒光定量PCR檢測方法》

小反芻獸疫病毒與羊傳染性膿皰病毒雙重Detectionmethodofpestedespetitsruminantsvirusandorfvir2023-07-20發布2023-09-20實施新疆維吾爾自治區市場監督管理局發布本文件按照GB/T1.1--2020《標準化工作導則第1產建設兵團畜牧獸醫工作總站。蘇曉慧、薛文、秦菊、努爾麥麥提阿穆提、居馬別克夏拉巴依、馬亞珍、符玉涓、艾日登才次克、李璐、張丹、沙那瓦爾塔希、任娟、美熱木古麗巴依待拉提、烏那爾汗吉斯汗、孫曉明、馮冰、陳玲、高姍姍、顏成旭、陸桂麗、茹仙古麗木明、加米拉、加伊娜古力、特列克庫拉別克。維吾爾自治區動物疾病預防控制中心(新疆烏魯木齊市高新技術產業開發區藍病預防控制中心(北京市大興區天貴大街17號)、北京億森寶生物科技有限公司(北京市北京經濟技術開發區(通州)科創東五街2號)、新疆畜牧科學院獸醫研究所(新疆畜牧科學院疆烏魯木齊市高新技術產業開發區冬融街726號)、新疆生產建設兵團畜牧獸醫工作總站(新疆烏魯木齊市米東區米東南路2188號紅光雅居小區7號公建樓)、新疆維吾爾自治市新華南路167號)。疆維吾爾自治區動物疾病預防控制中心(新疆烏魯木齊市高新技術產業開發區藍疫病預防控制中心(北京市大興區天貴大街17號)、新疆維吾爾自治區市場監督新疆維吾爾自治區畜牧獸醫局聯系電話傳真郵編：830004新疆維吾爾自治區動物疾病預防控制中心聯系電話傳真郵編：中國動物疫病預防控制中心聯系電話傳真郵編：100125北京億森寶生物科技有限公司聯系電話傳真郵編：100176新疆維吾爾自治區市場監督管理局聯系電話傳真郵編：830004工2規范性引用文件僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本4試劑和引物檢測引物探針見附錄B。5儀器用具與耗材6操作步驟選擇處于發熱期(體溫40℃~41℃)、排出膿性、漿液性眼分泌物、出現口腔潰瘍癥狀的活畜采工2(0.01mol/LpH7.4,PBS)中。將含有滲出物的棉拭子在微量振蕩器上去拭子。12000r/min離心5min,吸取上清300山于1.5mL滅菌離心管中，編號備用。選擇剛被撲殺或者死亡時間不超過24h的病畜采集組織樣品。無菌采集腸系膜和支氣管淋巴結各3個~4個，脾、胸腺、腸粘膜和肺組織各約25g~50g,分別置于50mL離心管或密封袋中。每份組織分別從三個不同位置取樣，稱取樣品約1g,用手術剪剪碎的樣品混勻后取0.1g裝入研磨管，于高通量研磨儀中研磨，加入1.5mL0.01mol/LpH7.4PBS繼續研磨，待勻漿后轉至1.5mL滅菌離心管中，12000樣品采集后，放置有冰盒的采樣箱里送至實驗室，在24h內進行檢測。6.3DNA/RNA的提取6.3.1取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分別加入裂解液600μ,充分顛倒混勻，室溫靜置36.3.2將液體吸入吸附柱中，12000r/min離心30s。6.3.3棄去收集管中液體，加入600μ洗滌液，12000r/min離心30s。6.3.4重復上述步驟6.3.3。6.3.5棄去收集管中液體，12000r/min離心2min,以除去殘留的洗滌液。6.3.6將吸附柱移入新的1.5mL無菌離心管中，向柱中央加入洗脫液60山。6.3.7室溫靜置2min,12000r/min離心1min,離心管中液體為核酸模板。得到的核酸模板盡量在2h內進行實時熒光擴增，若需長時間保存須放置-70℃冰箱，但應避免反復凍融。6.3.8若使用核酸提取儀提取核酸，則按DNA/RNA提取試劑盒說明書進行操作。6.4.1試驗前20min從-20℃冰箱中取出試劑盒等相應試劑，使試劑完全溶解。6.4.2每個檢測反應體系總量為15μ:14μ山的熒光PCR反應液，1L的酶混合物。6.4.3蓋緊PCR反應管蓋后將PCR反應管轉移至樣本準備區，剩余試劑放回-20℃冰箱冷凍保存。6.5加樣(樣本準備區)6.5.1分別向上述PCR反應管中加入已提取樣本核酸模板各5μ,陽性對照和陰性對照核酸模板各加5μL,記錄加樣順序。36.5.2蓋緊管蓋，瞬時離心36.6.1開機預熱，檢查儀器性能。6.6.2將PCR反應管放在樣品槽中相為：45℃10min,1個循環；95℃10min,1個循環；95℃15s,60℃45s,40個循環，在每性膿皰病毒陽性質粒作為陽性對照，同時以雙蒸水代替模板作為陰性對照。分別提取樣品和對照品的6.7.2.1陰性對照：無擴增曲線且Ct值>38或無Ct值。6.7.2.2陽性：Ct值≤30,有明顯指數增長，呈典型的S型曲線。獸疫病毒和羊傳染性膿皰病毒核酸。若在“FAM”標記下出現典型的擴增曲線且Ct值≤35,則判定樣本中小反芻獸疫病毒核酸陽性。若在“HEX”標記下出現典型的擴增曲線且Ct值≤35,則判定樣本中羊傳染性若被檢樣本的PCR反應體系通道無典型擴增曲線，且Ct值>38或無Ct值，則判定樣本小反芻獸疫病4(規范性)A.1pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)氯化鈉氯化鉀二水合磷酸氫二鈉磷酸二氫鉀滅菌雙蒸水A.2EDTA-Na?(0.5mol/L,pH=8.0)溶液配制滅菌雙蒸水氫氧化鈉滅菌雙蒸水氯化鈉11.70g三羥甲基氨基甲烷9.46g0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液(EDTAA.4洗滌液磷酸二氫鉀氯化鈉滅菌雙蒸水A.5洗脫液磷酸二氫鉀滅菌雙蒸水5(規范性)實時熒光PCR檢測B.1引物序列根據已報道的PPRV和ORFV的基因組序列各設計1套用于特異性擴增的引物和探針，具體引物信息與基因片段大小見表B.1和B.2。表B.1小反芻獸醫病毒引物序列及目的片段長度引物引物序列(5′→3)預期片段大小/bp引物探針FAM-CTCGGAAATCGCCTCGCAGGC表B.2羊傳染性膿皰病毒引物序列及目的片段長度引物引物序列(5′→3)預期片段大小/bp引物探針HE