干細胞片富含血小板血漿磷酸鈣顆粒用于骨修復的研究

干細胞片/富含血小板血漿/磷酸鈣顆粒用于骨修復的研究背景在臨床中因創傷、腫瘤、感染等原因導致的骨折以及骨缺損的重建常常需要外科手段的治療。在諸多的治療方法中,自體骨移植仍被認為是骨缺損治療的金標準。但是自體骨移植存在一些缺點,例如供區組織有限,供體部位發病率,增加患者手術痛苦與風險等。特別是在針對大段骨缺損的修復時,這些問題顯得尤為突出,這無疑限制了自體松質骨移植技術在臨床中的應用。對于異體骨移植又存在感染外源疾病和引起免疫反應的風險。近年來,隨著組織工程研究的興起,嘗試用組織工程的方法來修復骨或重建缺損逐漸成為研究的熱點,組織工程是建立在種子細胞、生長因子和生物材料支架三要素基礎上的。干細胞具有多向分化潛能,并且在骨組織工程中廣泛應用,而骨髓來源的間充質干細胞獲取途徑簡單方便,是良好的種子細胞,此外研究表明干細胞在高密度培養后會形成細胞片層狀結構,即干細胞片；生長因子能誘導干細胞定向分化,在應用中可以促進骨缺損的修復,但是生長因子價格昂貴(如BMP-2),尋找能發揮同生長因子效應的藥物或自體來源的生長因子具有深遠意義,研究表明辛伐他汀可以刺激內源性的細胞分泌BMP-2,而自體來源的富含血小板血漿(PRP)含有多種生長因子；對于生物材料,硫酸鈣由于其優良的生物相容性和骨傳導性,磷酸鈣由于其組成與骨組織一致,兩種材料都在骨組織工程中廣泛應用,因此在本課題中研究辛伐他汀、PRP對干細胞的作用以及MSC細胞片、載有辛伐他汀的硫酸鈣支架、MSC細胞片聯合PRP凝膠/納米磷酸鈣在骨組織工程中的應用,從而對其潛在的臨床應用價值進行了檢測和評估。本課題主要從以下五個方面進行了研究：(1)局部緩慢釋放的辛伐他汀/硫酸鈣支架在尺骨長段骨缺損再生修復中的應用研究；(2)辛伐他汀對大鼠骨髓來源的間充質干細胞和細胞片的增殖、分化的作用；(3)間充質干細胞片移植促進骨折愈合的應用研究；(4)富含血小板血漿/納米磷酸鈣對間充質干細胞的作用；(5)間充質干細胞片復合富含血小板血漿凝膠/納米磷酸鈣修復骨缺損的研究。第一部分局部緩慢釋放的辛伐他汀/硫酸鈣支架在尺骨長段骨缺損再生修復中的應用研究目的研究辛伐他汀從載有辛伐他汀的硫酸鈣支架的釋放及載有辛伐他汀的硫酸鈣支架促進骨組織的再生修復作用。方法和結果在體外實驗中將0.5mg辛伐他汀與硫酸鈣粉末(16.mg和480mg)混合制作成載有辛伐他汀的硫酸鈣支架,并測定辛伐他汀的釋放曲線,結果顯示在第1天辛伐他汀能有效的較大量的從硫酸鈣支架中釋放,隨著時間持續能穩定的釋放。體內動物實驗：36個完整的1.2厘米的兔尺骨骨缺損分別植入硫酸鈣支架、載有辛伐他汀的硫酸鈣支架和載有rhBMP-2的硫酸鈣支架。術后4和8周行影像學和組織學分析,結果顯示載有辛伐他汀的硫酸鈣支架和載有rhBMP-2的硫酸鈣支架組治療的骨缺損的X射線評分和新生骨面積明顯的高于硫酸鈣支架組(P<0.05)。但是載有辛伐他汀的硫酸鈣支架和載有rhBMP-2的硫酸鈣支架組在X射線評分和新生骨面積無顯著性差異(P>0.05)。結論體內局部緩慢釋放的辛伐他汀能促進骨組織的再生,而且這種促進骨組織再生的作用與rhBMP-2作用相似,這種載有辛伐他汀的硫酸鈣支架在骨組織工程中可能有很大的應用前景。第二部分辛伐他汀對大鼠骨髓來源的間充質干細胞和干細胞片的增殖、分化的作用目的研究辛伐他汀對大鼠骨髓來源的間充質干細胞增殖、分化的影響以及對干細胞片的分化作用方法和結果不同濃度的辛伐他汀與MSCs共培養1、3、7天后MTT檢測各種濃度的辛伐他汀對MSCs的增殖影響,當辛伐他汀濃度高于1μM時將會對細胞增殖產生抑制作用,在MTT實驗基礎上,用0.01μgM、0.1μM、1μM濃度的辛伐他汀與MSCs共培養,另設立未處理MSCs為對照組,3天和7天后檢測BMP-2,ALP,OCN,OPG和VEGF等基因表達差異；結果顯示辛伐他汀誘導組這些基因的表達量顯著高于對照組,而且隨著濃度的增高,基因表達量也增加；當MSCs高濃度培養后可以形成細胞片層狀結構,1μM辛伐他汀與MSC細胞片共培養7天后,檢測BMP-2,ALP,OCN,OPG和VEGF等基因表達情況,另設立未處理MSc細胞片組作為對照組,結果顯示：辛伐他汀誘導MSC細胞片組的BMP-2,ALP,OCN,OPG和VEGF等基因表達量顯著高于未處理MSC細胞片組。結論低濃度的辛伐他汀能促進MSCs和MSC細胞片的骨向分化和血管發生,這種具有骨向分化和血管發生的MSC細胞片在骨組織工程中將有廣闊的應用前景。第三部分骨向分化和血管發生的MSc細胞片促進骨折愈合的應用研究目的辛伐他汀誘導后的具有骨向分化和血管發生的MSC細胞片能加速骨折愈合。方法和結果大鼠骨髓來源的間充質干細胞(MSCs)高密度培養形成MSC細胞片,然后與1μM辛伐他汀共培養7天后,取下細胞片用于體內移植。20只大鼠,在其脛骨中上段鋸斷制造骨折模型,用lmm的注射器針頭髓內固定,在骨折處用辛伐他汀誘導后的MSC細胞片包裹,未處理組作為空白對照,術后2周和8周進行X線、micro-CT和組織學分析。術后2周和8周MSC細胞片組的X線評分顯著高于對照組,組織學和micro-CT顯示：術后2周MSC細胞片組的骨折部位部分形成了連接,術后8周形成較好的骨性連接,而對照組纖維組織仍填充骨折處,形成骨不連。結論具有骨向分化和血管發生的MSC細胞片促進骨組織再生,治愈了脛骨骨折。這種方法可能有助于臨床中骨折、骨折延遲愈合和骨不連的治療。第四部分磷酸鈣納米顆粒、富含血小板血漿對大鼠骨髓來源的間充質干細胞的增殖、分化作用目的研究磷酸鈣納米顆粒、富含血小板血漿對大鼠骨髓來源的間充質干細胞增殖、分化的影響。方法和結果制備直徑140nm左右的磷酸鈣納米顆粒和從大鼠心臟血中提取富含血小板血漿(PRP)。將不同濃度的磷酸鈣納米顆粒(0.001%,0.01%,0.1%)與MSCs共培養1、3、7天后MTT檢測各種濃度的磷酸鈣納米顆粒對MSCs的增殖影響,結果顯示磷酸鈣納米顆粒對MSCs的增殖具有濃度依賴性的抑制作用,當磷酸鈣納米顆粒濃度為0.01%,0.1%時會對細胞增殖產生抑制作用,0.001%濃度的磷酸鈣納米顆粒對MSCs增殖無影響；在MTT實驗基礎上,用0.001%濃度的磷酸鈣納米顆粒或0.001%濃度的磷酸鈣納米顆粒復合PRP與MSCs共培養,另設立MSCs為對照組,7天后檢測ALP和OCN基因表達差異；結果顯示：磷酸鈣納米顆粒誘導組這些基因的表達量顯著高于對照組,茜素紅染色顯示有骨向分化的鈣結節；當PRP(10μL)與磷酸鈣顆粒共同與MSCs培養時,磷酸鈣納米顆粒與PRP共同誘導組的這些基因的表達量進一步提高,鈣化結節更明顯。結論磷酸鈣納米顆粒對MSCs的增殖有濃度依賴性；磷酸鈣納米顆粒能促進MSCs的骨向分化；PRP聯合磷酸鈣納米顆粒能協同作用促進MSCs的骨向分化。第五部分間充質干細胞片復合富含血小板血漿凝膠／納米磷酸鈣修復骨缺損的研究目的間充質干細胞片聯合富含血小板血漿凝膠／納米磷酸鈣復合物能協同作用促進骨組織再生修復。方法和結果大鼠骨髓來源的間充質干細胞(MSCs)高密度培養形成MSC細胞片,制備直徑140nm左右的磷酸鈣納米顆粒和從大鼠心臟血中提取富含血小板血漿,將10μLPRP、10μL激活劑(含100U/ml牛凝血酶的10%氯化鈣溶液)和10mg磷酸鈣顆粒同時混合,然后放入37℃培養箱使之反應形成凝膠/顆粒混合物。當MSCs;形成細胞片后,將已經制作好的PRP凝膠/磷酸鈣顆粒混合物放到展開的細胞片上,用細胞片包裹混合物后即得到細胞片包裹的PRP凝膠/磷酸鈣顆粒混合物；細胞片包裹單獨的磷酸鈣顆粒為細胞片/磷酸鈣顆粒混合物。30只大鼠,在股骨中段做一個2.5×5.0mm的骨缺損,在骨缺損分別植入納米磷酸鈣、PRP凝膠/納米磷酸鈣、MSC細胞片/納米磷酸鈣、MSC細胞片/PRP凝膠/納米磷酸鈣,未處理組作為空白對照,術后4周進行大體觀察、X線和組織學分析。另外為了追蹤移植的MSc細胞片的存活情況,MSCs首先用CM-Dil標記,然后再培養成MSC細胞片,然后包裹PRP凝膠/納米磷酸鈣植入到另外2只大鼠的4個骨缺損處,術后2周用Maestro動物多光譜影像系統和激光共聚焦進行觀察。結果顯示：植入的MS