大鼠三叉神經本體覺中樞通路中vglu1樣陽性終末的分布

大鼠三叉神經本體覺中樞通路中vglu1樣陽性終末的分布

該研究團隊過去曾多次研究三叉神經主體感覺喪失的中樞神經通道，并對三叉神經中腦核（me）和丘腦后縱切核（vpm）之間的行為進行了驗證。其中組成“四級通路”的核團依次為Vme、三叉神經脊束核吻側亞核背內側部及其鄰接的外側網狀結構(Vodm-LRF)、“帶狀區”和丘腦VPM。其中“帶狀區”由三叉神經感覺主核的背內側部(dorsomedialpartoftheprincipalsensorytrigeminalnucleus,Vpdm)、三叉上核的尾外側部(caudolateralpartofthesupratrigeminalnucleus,Vsup-CL)、三叉神經運動核腹側區(theareaventraltomotortrigeminalnucleus,AVM)和上橄欖核背側區(theareadorsaltothesuperioroliverynucleus,ADO)四個核團組成。眾所周知,谷氨酸(glutamate,Glu)在口面部本體感覺信息向中樞上位腦結構的逐級傳遞中起著十分重要的作用。最近已經克隆出三種囊泡膜谷氨酸轉運體(vesicularglutamatetransporter,VGluTs),分別被命名為I、II和III型囊泡膜谷氨酸轉運體(VGluT1,VGluT2和VGluT3)。已有大量研究表明,VGluT1和VGluT2廣泛地分布于以Glu為神經遞質的腦區,如丘腦、延髓和脊髓;超微結構研究也進一步觀察到,它們幾乎分布于非對稱性突觸的突觸前終末內,并被裝配在突觸小泡膜上,故目前人們已將VGluT1和VGluT2廣泛用作谷氨酸能神經終末的標識物。最近有一些資料也顯示,在大鼠腦干和脊髓內傳遞觸壓覺和本體覺信息的初級傳入纖維主要表達VGluT1,而傳遞傷害性信息的初級傳入纖維主要表達VGluT2;且VGluT1在Vme神經元胞體內的表達在生后發育期存在著消長變化。以上研究均提示,VGluT1可能與來自口面部和軀體本體覺信息的傳遞密切相關。但是,目前有關VGluT1樣陽性終末在三叉神經本體覺中樞傳導通路中的第三級核團內的表達及其終末來源等問題,尚未見報道。因此,本實驗綜合運用免疫組織化學、逆行束路追蹤和免疫熒光組織化學雙標技術,對VGluT1樣陽性終末在大鼠腦干“帶狀區”內的分布和來源、以及與向丘腦VPM投射神經元之間的聯系進行了研究,旨在為進一步闡明谷氨酸在三叉神經本體覺傳導通路中的作用提供可靠的形態學依據。材料和方法1.回復突變體ate雄性SD大鼠3只,體重250～280g,戊巴比妥鈉(80mg/kg)腹膜腔注射麻醉后,插管至升主動脈,先以100ml0.025mol/L的磷酸鹽緩沖液(phophate-buffersaline,PBS,pH7.3)沖洗血液,再用500ml含4%多聚甲醛的0.1mol/L的磷酸緩沖液(phophatebuffer,PB,pH7.3)灌注固定,持續30min以上。灌畢立即取腦,并移入含30%蔗糖的0.1mol/L的PB中,至其沉底(4℃)。冰凍切片機行腦干冠狀切片,片厚30μm,分為2套收集。第1套切片用于VGluT1的免疫組織化學染色。具體步驟如下:(1)兔抗VGluT1IgG(0.3μg/ml,日本京都大學金子武嗣先生惠贈)室溫下孵育過夜;(2)生物素結合的驢抗兔IgG(10μg/ml,Jackson)室溫下孵育4h;(3)ABC-Elite(1∶100,Vector)孵育切片3h。其中步驟(1)和(2)用含5%驢血清、0.05%疊氮鈉、0.5%TritonX-100和0.25%角叉菜膠的0.05mol/L的PBS稀釋,步驟(3)用含0.5%TritonX-100的0.05mol/L的PBS稀釋。上述反應完成后的切片進行DAB和H2O2呈色。所有切片進行脫水透明、DPX封片后光鏡下觀察并拍照。第2套切片用于對照實驗。用正常血清替代一抗血清進行免疫組織化學染色,結果為陰性。2.術后動物分組和處理雄性SD大鼠6只,體重250～280g,戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹膜腔注射麻醉后,開顱,根據Paxinos和Watson大鼠腦圖譜,將0.2μl含10%的四甲基羅達明(tetramethylrhodamine-dextranamine,TMR-DA,MolecularProbes)用尖端粘接微玻管的微量注射器緩慢經壓力注入一側丘腦VPM,注畢原位留針15min,以防止標記物沿針道擴散。術后動物存活7d后,如前文行麻醉、灌注固定、浸糖和切片,切片分3套收集。第1套切片直接裱在玻片上,用于檢查TMR注射區和TMR逆標神經元在“帶狀區”內的分布情況。第2套切片用于VGluT1免疫熒光組織化學染色。具體步驟如下∶(1)兔抗VGluT1IgG(0.5μg/ml,日本京都大學金子武嗣先生惠贈)室溫下孵育過夜;(2)生物素結合的驢抗兔IgG(10μg/ml,Jackson)室溫下孵育4h;(3)Alexa488標記的Avidin-D(10μg/ml,MolecularProbes)中室溫下孵育6h。抗體孵育液如前所述。第3套切片用于對照實驗。用正常血清替代一抗血清進行免疫熒光組織化學染色,結果為陰性。上述所有切片均在熒光顯微鏡(BX60,Olympus,Japan)下觀察(TMR的激發光波長540～552nm;發射光波長≥575nm;Alexa488的激發光波長450～490nm,發射光波長515～565nm)。用CCD攝像系統采集圖像。選擇較好的切片,進一步在激光共聚焦顯微鏡(FV1000,Olympus,Japan)下觀察TMR逆標神經元與VGluT1樣陽性終末之間的關系(TMR的激發光波長590nm;發射光波長615nm;FITC的激發光波長490nm,發射光波長520nm)。以上所攝取的圖片均用Photoshop7.0軟件調整對比度,以達到理想效果。3.感根和運動根的分離6只雄性SD大鼠(240～280g),在戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹膜腔注射麻醉后,經顱中窩暴露單側的半月節及三叉神經后根,并分離出感覺根和運動根,其中3只大鼠切斷感覺根,另3只大鼠切斷運動根。術后,前者存活7d,后者存活8周,然后如前文行麻醉、灌注固定、浸糖、切片以及進行VGluT1免疫組織化學染色。結果1.小不一硅系的陽性軸突終末分布在VGluT1免疫組織化學染色切片上,光鏡下可觀察到大量的VGluT1樣陽性軸突終末呈大小不一的棕色點狀,廣泛分布于“帶狀區”的四個核團內(Fig.1A)。特別是在Vsup和Vpdm內,VGluT1樣陽性軸突終末呈密集分布;而在三叉神經運動核腹側和上橄欖核背側的兩個較小核團(AVM和ADO)所在的區域內,也可見密集的VGluT1樣陽性終末(Fig.1A)。2.逆標神經元的細胞體將逆行追蹤劑TMR注入丘腦VPM后,在“帶狀區”的四個核團(即Vsup、Vpdm、AVM和ADO)內均可觀察到TMR逆標神經元的胞體(Fig.1B-D),其逆標神經元的分布模式與以往的報道完全一致。在進行VGluT1免疫熒光組織化學染色的切片上,可見大量的VGluT1樣陽性終末廣泛分布于TMR逆標神經元所在的區域內;進一步在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到部分VGluT1樣陽性終末包繞在TMR逆標神經元的胞體或樹突周圍,并與之形成密切接觸(Fig.1C-D,1C’-D’)。3.不同核團內vglut1的變化當切斷三叉神經感覺根或切斷三叉神經運動根后,在“帶狀區”內均可觀察到VGluT1樣陽性終末的表達發生了明顯變化,但這種變化在不同核團內有所不同。當切斷單側三叉神經感覺根7d后,可觀察到手術側Vpdm內的VGluT1樣陽性產物明顯有所下降,但其它三個核團未觀察到明顯變化(Fig.2A);而當切斷單側三叉神經運動根8周后,在手術側Vsup內可觀察到VGluT1樣陽性產物幾乎完全消失,但Vpdm、AVM和ADO內未發生明顯變化(Fig.2B)。vme神經元的中心分布VGluT1是一種囊泡膜谷氨酸轉運體,廣泛地分布于中樞神經系統谷氨酸能神經終末內。Landry等的研究表明,脊髓背角傳遞機械性感受或本體感覺的初級傳入終末均表達VGluT1樣免疫陽性。Todd等用跨節追蹤劑霍亂毒素B亞單位(choleratoxinbsubunit,CTb)標記大鼠后肢有髓纖維后,觀察到脊髓背角內被標記的有髓纖維終末均呈VGluT1樣免疫陽性。Wu等和我們課題組最近的研究也報道,傳遞后肢和口面部本體覺信息的外周感受器,如股三頭肌和咬肌肌梭內均可觀察到較強的VGluT1樣陽性末梢呈螺旋形環繞在梭內肌纖維的中央區。本實驗在三叉神經本體覺中樞通路的三級核團,即“帶狀區”的四個核團內也觀察到大量的VGluT1樣陽性終末呈串珠狀分布,其結果與以往報道一致。眾所周知,三叉神經運動根由三叉神經運動核(motortrigeminalnucleus,Vmo)和Vme發出的纖維合并而成,其中Vme神經元的周圍突主要分布于上、下頜牙齒及牙周膜的機械感受器和閉口肌的肌梭,傳遞口面部的本體覺信息;而傳遞口面部觸壓覺信息的初級神經元的胞體主要位于三叉神經節(trigeminalganglion,TG),其中樞突在腦干內有一個較為廣泛的投射區,其中包括Vsup-CL和Vpdm。本實驗在切斷三叉神經感覺根7d后,即去除三叉神經節細胞的投射后,手術側“帶狀區”內可觀察到Vpdm內的VGluT1樣陽性物質的表達比正常側明顯有所下降,但其他核團無變化;而切斷三叉神經運動根8周后,手術側“帶狀區”內只觀察到Vsup內的VGluT1樣陽性產物幾乎完全消失,但Vpdm、ADO和AVM內均未觀察到任何變化。2006年我們課題組曾經報道,將CTb注入外周咬肌神經后,除了Vme神經元的胞體被標記外,在Vsup-CL和Vmo內也可觀察到大量的CTb標記終末,且這些標記終末的絕大多數均表達VGluT1樣免疫陽性。另外,切斷一側下頜神經后,手術側與對照側相比,術后存活1周組的Vpdm內VGluT1樣陽性物質的表達有所下降。結合以往的研究,本實驗所觀察到的以上結果充分表明,“帶狀區”Vpdm內的VGluT1樣陽性終末主要來源于TG細胞;位于Vsup-CL的那些VGluT1樣陽性終末則主要來源于Vme神經元的中樞突,而ADO和AVM內的VGluT1樣陽性終末既不來自于TG細胞,也不來自于Vme神經元,我們推測很有可能來自于中樞其他腦區,但此來源的具體部位則有待于今后進一步深入研究。以往的束路追蹤研究已經表明,大鼠“帶狀區”為口面部本體感覺信息向丘腦VPM傳遞通路中的第三級中繼核團,它接受Vodm-LRF的投射,然后再將本體覺信息傳向丘腦VPM。本研究在激光共聚焦顯微鏡下在“帶狀區”的四個核團內均觀察到部分VGluT1樣陽性終末包繞在TMR逆標神經元的胞體或樹突周圍,并與之形成密切接觸。顯然,傳遞口面部本體覺信息的Vme神經元的軸突終末與傳遞口面部觸壓覺信息的TG細胞的軸突終末在Vsup-CL和Vpdm內進行了匯聚,然后又將匯聚整合后的信息傳向丘腦VPM;而在將這些匯聚后的信息向丘腦傳遞的過程中,谷氨酸發揮著重要作用。綜上