化學蛋白質組學精品專業課件

化學蛋白質組學1精品PPT歡迎下載可修改人類基因組計劃的順利實施，使生命科學研究的重心逐漸轉移到對生物功能的整體研究上。對生物功能的主要體現者或執行者--蛋白質的表達模式和功能模式的研究必然成為生命科學發展的趨勢。2精品PPT歡迎下載可修改在20世紀90年代中期，國際上萌發了一門研究細胞內各種蛋白質的組成及其活動規律的新興學科--蛋白質組學(proteomics)。蛋白質組(proteome)這一概念是1995年由澳大利亞學者最先提出來的，源于蛋白質（protein）與基因組（genome）兩個詞的雜合，指的在一個特定的時間和空間內，一個基因組?一種細胞組織或一種生物體所表達的全部蛋白質。對蛋白質組問題的研究稱之為蛋白質組學(proteomics)，主要是在整體水平上研究細胞內蛋白質的組成及其活動規律。3精品PPT歡迎下載可修改而化學在這里再一次與生物學的最新發展融合，形成新的交叉研究領域-化學蛋白質組學(chemicalproteomics)。化學蛋白質組學是一個目前仍在不斷擴展中的全新領域，學術界至今對其尚未有確切定義。一定程度上，化學蛋白質組學可以理解為“化學加蛋白質組學”。具體地說，由于大多數蛋白質的功能直接依賴于小分子配體與靶蛋白的結合步驟，因此，利用能夠與靶蛋白質特異作用的化學小分子來擾動和探測蛋白質組，有可能在蛋白質組的整體水平上，揭示感興趣的特定蛋白質的功能以及它們與化學小分子的相互作用?化學蛋白質組學利用化學小分子直接從功能角度切入蛋白質組的研究，有別于以往的主要以蛋白質定性定量鑒定為基礎的蛋白質組學技術，因此，被認為是很有前途的新一代功能蛋白質組學技術(function-basedproteomics)。4精品PPT歡迎下載可修改一，化學蛋白質組學的研究方法蛋白質組學從整體上對體系內蛋白質進行研究，常見3種研究模式：第1種是檢測蛋白質組理化參數的“完全蛋白質組學”；第2種是差異蛋白質組學，主要通過比較分析不同狀態下蛋白質表達圖譜，實現對體系內代謝調控的動態監測，從而更易于揭示機體對內外界環境變化產生反應的本質規律；第3種主要是蛋白質功能模式的研究，包括蛋白質的功能及蛋白質間的相互作用。5精品PPT歡迎下載可修改化學蛋白質組學的主要任務在于，發展和應用具有生物活性的靶向探針，用于復雜的蛋白質組中的特異性酶或蛋白質家族的功能研究。小分子與細胞內靶蛋白質的相互作用，是很多蛋白質生物功能的基礎。這種相互作用強弱不一，既可以是可逆的，也可以是不可逆的；可以是單靶點的，也可以是同時作用于多個靶蛋白的。生物體(細胞?組織等)蛋白質組的所有蛋白質經化學小分子處理前后的差異蛋白質組展示(proteomeprofiling)，可以用來研究這種相互作用。對化學學科而言，通過功能蛋白質組學的研究服務于人類的健康，促進分子醫學的發展，如尋找先導藥物以及藥物的靶分子是其重要的目標。6精品PPT歡迎下載可修改（一）蛋白質組學的基本技術流程目前，蛋白質組學研究通常有三個步驟：第一，運用雙向電泳技術分離樣品中的蛋白質；第二，應用質譜技術鑒定通過雙向電泳分離出來的蛋白質；第三，應用生物信息學技術存儲、處理、比較獲得的數據。7精品PPT歡迎下載可修改1，雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳

1975年O’farrell和Klose首先在兩個實驗室分別建立了雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(twodimensionalpolyacrylamidegelelectrophoresis，2-DE電泳)，其基本原理是利用不同蛋白質具有不同等電點(pI)和不同分子量大小的特點將它們分離。他們將高分辨率的等電聚集電泳(isoelectrofocusing，IEF)和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)聯合組成雙向電泳，第一向為IEF，采用經典的兩性電解質載體在電流作用下形成pH梯度，依據pI的不同進行分離；第二向利用SDS根據分子量大小進行分離。

8精品PPT歡迎下載可修改9精品PPT歡迎下載可修改2，基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜技術基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜測量法以多肽質量/電荷比為依據同數據庫資料進行比較,進而對蛋白質進行鑒定。此法通常被稱為肽質量指紋法。10精品PPT歡迎下載可修改9、人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:33:54PM11、人總是珍惜為得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20232023/2/32023/2/32023/2/315、一個人炫耀什么，說明他內心缺少什么。。二月232023/2/32023/2/32023/2/32/3/202316、業余生活要有意義，不要越軌。2023/2/32023/2/303February202317、一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不息。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/33，色譜與質譜聯用技術

將色譜技術與新型質譜技術相結合,可有效地克服雙向凝膠電泳/質譜的不足,確保了分析的準確性。首先對蛋白質混合物進行酶切得到混合肽段,然后通過強離子交換反相色譜柱進行多次分離,并連用液相色譜-串聯質譜分析肽段,而且通過核素標記肽段的技術實現蛋白定量分析。分離后的產品離子得到完好地掃描,連用分析肽段,可以區分待測蛋白質和其他類似物。12精品PPT歡迎下載可修改9、人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:33:54PM11、人總是珍惜為得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20232023/2/32023/2/32023/2/315、一個人炫耀什么，說明他內心缺少什么。。二月232023/2/32023/2/32023/2/32/3/202316、業余生活要有意義，不要越軌。2023/2/32023/2/303February202317、一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不息。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/314精品PPT歡迎下載可修改4，信息查詢生物信息學(Bioinformatics)是生物與計算機以及應用數學相互結合而形成的一門新興學科。它通過對生物學實驗數據的獲取、加工、存儲、檢索與分析,達到解釋數據所蘊含的生物學意義的目的。蛋白質組學研究任一物種的基因組編碼的全套蛋白質,它通常是高通量的,在進行蛋白質功能預測和結構分析時,生物信息學就成為蛋白質組學研究的核心技術之一。15精品PPT歡迎下載可修改常用幾種軟件進行分析。PeptIdent是以肽質量指紋譜數據鑒定蛋白質的查詢軟件,是將數據庫中的所有蛋白質用我們選定的酶進行“理論消化”形成肽片段,計算其理論肽段質量,建立索引,然后再與輸入的實驗數據進行對比,按實驗數據匹配數的多少排列并輸出匹配結果。蛋白質的等電點、分子量和種屬可以詳細限制候選蛋白,減少假陽性誤差。MS-Fit和Mascot軟件利用了MOWSE得分法,特別考慮數據庫中肽段分布頻率的問題。Mascot軟件還把MOWSE得分轉換為絕對概率,減少結果的不確定性。16精品PPT歡迎下載可修改蛋白質組學相關網站

蛋白質組研究技術、信息等。

從新藥開發角度，發現新蛋白及新作用。

可以找到蛋白質組研究相關企業、各種儀器來源、新聞等。

teome.co.uk各種蛋白質組研究相關信息

http://www.micromass.co.uk介紹蛋白質鑒定的先進儀器

http://www.expasy.ch蛋白質鑒定專家系統，SwissInstituteofBioinformatics

.au蛋白質鑒定專家系統，AustralianProteomeAnalysisFacility

http://expasy.cbr.nrc.ca蛋白質鑒定專家系統，CanadianBioinformaticsResours17精品PPT歡迎下載可修改二、功能蛋白質組學技術功能蛋白質組學主要是研究蛋白質功能、蛋白質－蛋白質相互作用、蛋白質－小分子相互作用，其方法主要有蛋白質陣列技術(proteinarrays)、噬菌體展示技術(phagedisplay)、基因芯片技術(cDNAmicr-oarray)、酵母雙雜交技術等。而通過篩選小分子配體來描述新蛋白的功能，是化學蛋白質組學的主要研究內容，化學蛋白質組篩選也將提供新藥開發的先導化合物。共價結合于目標蛋白質、便于純化和鑒定的化學探針，無疑是該領域最為重要的工具。可利用化學探針在純化的蛋白質、細胞裂解物、活細胞和活動物等不同水平，評價藥物作用強度和選擇性。一方面，可鑒別與不同疾病相關的新型藥物靶點；另一方面可用于藥物先導化合物的快速鑒定，從而加快候選化合物應用于臨床的進程。其中基于靶酶活性的特異化學小分子探針(activity-basedprobes，ABPs)是一種新的化學蛋白質組學研究技術。18精品PPT歡迎下載可修改activity-basedprobes，ABPs該技術的原理是：合成同時帶有反應基團和標簽基團的ABPs試劑與待研究的蛋白質組作用(ABPs中的反應基團能夠特異性共價修飾蛋白質組中的某類酶蛋白而將化學小分子“掛”到感興趣的靶酶上，然后，利用ABPs中的熒光或生物素標簽基團又可將這些靶酶一個個地從蛋白質組中“釣”出來)。由于ABPs是針對待研究靶酶的活性而定向設計的化學小分子，因而能夠直接檢測蛋白質組中感興趣的靶酶的活性。ABP的分子量通常在700-1000D，這主要是由于報告基團(熒光基團或生物素)造成的，這些報告基團還可能改變活性分子在體內的性質及其與靶蛋白的作用模式，并因此限制了ABP分子在體內細胞的吸收與分布。ABPP實驗一般都是在體外進行的，如細胞或組織勻漿液，這種實驗方式可能會改變細胞或組織內活性酶或非活性酶的濃度及它們各自的亞細胞分布。因此，體外的功能蛋白質組學研究只能大致地揭示活細胞或動物體內組織中蛋白質的功能狀態。19精品PPT歡迎下載可修改1，不可逆探針就其主要基礎性結構而言，不可逆的化學探針具有三種特異的功能部位：與酶共價交聯的反應基團，調節反應基團反應特異性的鏈接區和一個便于鑒別和純化目標酶的標記物。（1）反應基團反應基團為靶蛋白質提供必要的共價修飾，其選擇性的高低是化學探針設計過程中的最大的挑戰?其難度在于功能基團的二元性，一方面具有特定蛋白質中氨基酸殘基的反應性，另一方面不識別細胞或細胞抽提物的其他活性片段。（2）鏈接區通常采用長鏈烷或聚乙二醇作為化學探針的鏈接區，連接反應基團和標記物。主要在反應基團和標記物之間提供足夠的空間以阻止空間障礙的形成，便于反應基團與酶的結合以及對結合物的純化。烷基鏈可調節探針的疏水性，使其便于進入活細胞和組織；而聚乙二醇鏈可提高疏水探針的溶解性，便于進入水溶液。20精品PPT歡迎下載可修改（3）標記物一般選用生物素、熒光物質和放射性物質作為化學探針的標記物，可快速鑒別和純化探針所修飾的蛋白質。蛋白質凝膠電泳是最簡單有效的蛋白質分離方法，因此用于標記探針的物質應兼容于SDS法。21精品PPT歡迎下載可修改22精品PPT歡迎下載可修改23精品PPT歡迎下載可修改24精品PPT歡迎下載可修改25精品PPT歡迎下載可修改26精品PPT歡迎下載可修改目前,該方法已成功地分別用于針對絲氨酸蛋白酶，巰基蛋白酶，去泛蛋白化酶等靶酶的功能蛋白質組研究,并從中發現了一些化學小分子體內作用的疾病相關新靶點。27精品PPT歡迎下載可修改28精品PPT歡迎下載可修改2，可逆探針由于不可逆探針的設計受到對蛋白質（酶）活性中心結構信息、小分子化合物對酶抑制部位信息等缺乏的局限性，人們希望直接用可逆抑制劑作為化學探針，這種方法有望擴展于針對所有靶蛋白質的功能蛋白質組研究，并可用于新藥篩選。

29精品PPT歡迎下載可修改3，無標記探針ABPP實驗一直是在細胞或組織勻漿液中進行的，一個主要的原因是報告基團體積很大(分子量通常在700一10o0Da)，限制了探針分子的吸收、分布，甚至可能改變探針分子的作用模式)。近年來，ABPP實驗引入了click-chemistry，發展了沒有標簽(tag-free)的探針分子，報告基團(熒光素或生物素)是在探針分子共價標記了靶蛋白后，通過Huisgen1,3-偶極環加成反應(炔基與疊氮基反應形成穩定的三氮唑結構)連接到探針分子上。Sharpless等發現在Cu(I)催化下炔基與疊氮基可以在溫和的條件下高產率得到三氮唑，這一發現使得click-chemistry可以有效地運用到功能蛋白質組學的研究。30精品PPT歡迎下載可修改31精品PPT歡迎下載可修改32精品PPT歡迎下載可修改無標記探針分子的設計需要運用光親和標記技術，引入光親合標記基團(photoaffinitylabelinggroup)，其作用是在探針分子與靶蛋白結合(可逆)后，通過光解作用在探針分子與靶蛋白之間引入共價鍵。通常這類探針分子包括活性部位(activityunit)、光親合標記基團、連接部位及報告基團。33精品PPT歡迎下載可修改光親和標記探針分子的光親和基團有：苯基疊氮類(phenylazides)、trifluoromethylphenyldiazirine、二苯甲酮類(benzophenone)等。通常理想的光親和基團應具備以下幾個特征:(1)具有一定的化學穩定性，能耐受普通的化學反應；(2)在自然光中合理的穩定性；(3)在黑暗中穩定，在不對生物樣品造成損傷(>300nm)的紫外光照下很容易光解；(4)光解后的活性中間體既能與親核的X-H(X=N,S,O)官能團反應，也能與C-H官能團反應。光解中間體與受體作用得到的產物應該比較穩定，能夠耐受分離、純化和分析等操作。光親和標記-ABPP(CC-ABPP)實驗目前只是局限于共價作用的探針分子的設計、研究，但是在很多情況下我們所能得到的活性小分子與蛋白質的作用方式是非共價的，此時就希望將click-chemistry引入到光親和標記技術中，設計非共價作用的探針分子進行蛋白質組學研究，成為蛋白質組學研究的更強有力的工具，對藥物的發現起到更大的推動作用。34精品PPT歡迎下載可修改35精品PPT歡迎下載可修改36精品PPT歡迎下載可修改37精品PPT歡迎下載可修改38精品PPT歡迎下載可修改39精品PPT歡迎下載可修改40精品PPT歡迎下載可修改41精品PPT歡迎下載可修改42精品PPT歡迎下載可修改43精品PPT歡迎下載可修改44精品PPT歡迎下載可修改45精品PPT歡迎下載可修改46精品PPT歡迎下載可修改47精品PPT歡迎下載可修改48精品PPT歡迎下載可修改49精品PPT歡迎下載可修改化學探針可用于藥效研究。通過分析候選藥物和化學探針之間簡單的競爭結合,鑒別出復雜的蛋白質組中藥物靶點。同時,可利用更貼近生理條件的天然酶,驗證候選藥物的功效。此外,可采用相關的組織樣本,分析候選藥物抑制特異性靶點的能力。可利用化學探針在純化的蛋白質、細胞裂解物、活細胞和活動物等不同水平,評價藥物作用強度和選擇性。化學蛋白質組學是一個多學科交叉的領域,很大程度上提升了我們對生物學和藥物發展的理解。共價結合于目標蛋白質、便于純化和鑒定的化學探針,無疑是該領域最為重要的工具。一方面,可鑒別與不同疾病相關的新型藥物靶點;另一方面可用于藥物先導化合物的快速鑒定,從而加快候選化合物應用于臨床的進程。

50精品PPT歡迎下載可修改利用基于靶酶活性的特異化學小分子探針(activity-basedprobes，ABPs)來探測功能蛋白質組。該技術的原理是:合成同時帶有反應基團和標簽基團的ABPs試劑與待研究的蛋白質組作用(ABPs中的反應基團能夠特異性共價修飾蛋白質組中的某類酶蛋白而將化學小分子“掛”到感興趣的靶酶上，然后，利用ABPs中的熒光或生物素標簽基團又可將這些靶酶一個個地從蛋白質組中“釣”出來)。由于ABPs是針對待研究靶酶的活性而定向設計的化學小分子，因而能夠直接檢測蛋白質組中感興趣的靶酶的活性?目前，該方法已成功地分別用于針對絲氨酸蛋白酶?巰基蛋白酶?去泛蛋白化酶等靶酶的功能蛋白質組研究，并從中發現了一些化學小分子體內作用的疾病相關新靶點?51精品PPT歡迎下載可修改9、人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。03-2月-2303-2月-23Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。***2/