人教版選修一專題五課題三血紅蛋白的提取和分離(共33張PPT)

1、含量：占細胞干重的50％以上，是細胞中含量最多的有機化合物。2、組成元素：C、H、O、N3、基本單位：氨基酸蛋白質小知識氨基NH2COOH羧基HR—C—4、分子結構：氨基酸多肽蛋白質肽鍵：—CO—NH—5、相對分子質量：高分子化合物蛋白質小知識脫水縮合盤曲折疊1、分離生物大分子的基本思路是什么？選用一定的物理或化學的方法分離具有不同物理或化學性質的生物大分子。2、蛋白質的分離和提取的原理是什么？根據蛋白質各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質和多少、溶解度、吸附的性質和對其他分子的親和力，等等，可以用來分離不同種類的蛋白質。思考凝膠色譜法（分配色譜法）1、概念：根據被分離物質（如蛋白質）相對分子質量的大小，利用具有多孔網狀結構的凝膠的分子篩作用，來進行分離。性質：微小的多孔球體本質：多糖類化合物實例：葡聚糖、瓊脂糖凝膠色譜法分離蛋白質凝膠色譜法（分配色譜法）2、原理：

當相對分子質量不同的蛋白質通過凝膠時，相對分子質量較小的蛋白質容易進入凝膠內部的通道，路程較長，移動速度較慢；而相對分子質量較大的蛋白質無法進入凝膠內部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。相對分子質量不同的蛋白質分子因此得以分離。相對分子質量大小直徑大小大于凝膠顆粒孔道直徑小于凝膠顆粒孔道直徑運動路徑被阻擋在凝膠顆粒外面而迅速通過因擴散進入凝膠顆粒內部而被滯留運動速度較快較慢運動路程較短較長洗脫次序先后緩沖溶液1、概念：在一定的范圍內，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液pH發生明顯變化的溶液。2、作用：能夠抵制外界的酸或堿的對溶液的pH的影響，維持pH基本不變。3、配制：通常由1－2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調節緩沖劑的使用比例就可以制得在不同pH范圍內使用的緩沖液。還記得人體血液中的緩沖液嗎？H2CO3/NaHCO3

NaH2PO4/Na2HPO4你認為在血紅蛋白整個實驗中用的緩沖液是什么？目的是什么？本實驗使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細胞內的pH環境，保證血紅蛋白的正常結構和功能，便于觀察（紅色）和科學研究（活性）。電泳1、概念：指帶電粒子在電場作用下發生遷移的過程。2、原理：①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團會帶上正電或負電。②在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。③電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質的差異以及分子本身的大小，形狀的不同使帶電分子產生不同的遷移速度，從而實現樣品中各種分子的分離。3、類型：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙稀酰胺凝膠電泳應用：測定蛋白質分子量、進行蛋白質純度鑒定原理：蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。SDS：消除凈電荷對遷移率的影響。電泳用SDS測定蛋白質分子量的方法

使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質的分子量時，可選用一組已知分子量的標準蛋白同時進行電泳，根據已知分子量的標準蛋白的電泳區帶位置，可以測定未知蛋白質的分子量。市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的標準蛋白試劑出售。使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異

在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動瓊脂糖凝膠電泳示意圖電泳檢測結果瓊脂糖凝膠電泳實驗操作步驟樣品處理——粗分離——純化——純度鑒定

水分血漿固體物質血液白細胞血細胞血小板紅細胞血紅蛋白（90％）血紅蛋白的組成β

βα

α血紅素基因可攜帶一分子O2或一分子CO23.用雞的紅細胞提取DNA，用豬、牛、羊的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？

雞的紅細胞具有細胞核，含有DNA，便于進行DNA的提取；人的紅細胞無細胞核，結構簡單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。1、紅細胞的洗滌2、血紅蛋白的釋放3、分離血紅蛋白溶液4、透析（一）樣品處理問題：1、剛采集的血樣要做怎樣的處理？為什么？加入抗凝血劑，防止血液凝固。2、怎樣洗滌？采樣分離－吸漿倒紅－加液攪拌－重洗三次低速短時間離心生理鹽水1、紅細胞的洗滌②洗滌操作：1、采集血樣。2、低速短時間離心（速度越高和時間越長，會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀，達不到分離的效果）3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。4、鹽水洗滌：用五倍體積的質量分數為0.9％的氯化鈉溶液洗滌。5、低速離心（低速短時間）6、重復4、5步驟三次，直至上清液中已沒有黃色，表明洗滌干凈。3、洗滌的目的是什么？去除雜蛋白，以利于后續血紅蛋白的分離純化。4、洗滌干凈的標志是什么？直至上清液不再呈現黃色，表明紅細胞已洗滌干凈。1、紅細胞的洗滌2、血紅蛋白的釋放問題：加蒸餾水和甲苯的作用是什么？使紅細胞破裂，釋放出血紅蛋白。

加蒸餾水到原血液體積，再加40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分攪拌10分鐘（加速細胞破裂）,細胞破裂釋放出血紅蛋白。(3)分離血紅蛋白溶液：

①過程：將攪拌好混合液轉移到離心管內，以2000r/min的速度離心10min。②試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質沉淀層（暗紅色）。③分離：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。有機溶劑（無色透明的甲苯層）脂類物質（白色脂溶性物質沉淀層）血紅蛋白溶液（紅色透明液體）紅細胞破碎物沉淀（暗紅色沉淀物）3、分離血紅蛋白溶液高速離心－濾紙過濾－漏斗分液(4)透析：

①過程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時。

②透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質。該結果說明什么？

原理：透析袋（半透膜）能使小分子自由進出，而大分子保留在袋內。

透析法（二）凝膠色譜操作1、凝膠色譜柱的制作打孔→挖穴→安管→覆網→紗包→插管2、凝膠色譜柱的裝填固定色譜柱→配凝膠懸液→裝填色譜柱→洗滌平衡3、樣品的加入和洗脫調節緩沖液面→滴加透析樣品→樣品滲入凝膠床→洗脫→收集分裝蛋白質2.凝膠色譜操作:（1）凝膠色譜柱的制作：

①取長40厘米，內徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網，還會導致液體殘留，蛋白質分離不徹底。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應位置組裝成一個整體。⑤安裝其他附屬結構。2、凝膠色譜柱的裝填固定色譜柱－配凝膠懸液－裝填色譜柱－洗滌平衡磷酸緩沖液沸水浴加熱緊密

(pH為7.0)不得有氣泡（二）凝膠色譜操作（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇：A、材料：交聯葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5克。②凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠,浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。③凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性緩慢倒入色譜柱內，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。2、裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果。

④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時。（2）凝膠色譜柱的裝填50cm高注意：1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內的流動與最終生物大分子物質的分離效果。2、不能發生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現象。裝配好的凝膠柱3、樣品的加入和洗脫調節緩沖液面→滴加透析樣品→樣品滲入凝膠床→洗脫→收集分裝蛋白質磷酸緩沖液(1)不要觸及破壞凝膠面(pH為7.0)(2)貼壁加樣

(3)使吸管管口沿管壁環繞移動（二）凝膠色譜操作（3）樣品加入與洗脫①調節緩沖液面：打開下端出口，使柱內緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關閉出口。

②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，管口貼著管壁環繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。

③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內，等樣品完全進入凝膠層后，關閉下端出口。

④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續收集。（在分離過程中，如果紅色區帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）

（3）樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環繞移動。思考下面的問題：讓血紅蛋白處在穩定的pH范圍內，維持結構和功能正常。1、在血紅蛋白純化的整個過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？2、與其他蛋白質相比，血紅蛋白有什么特點？這一特點對你進行血紅蛋白的分離有什么啟示？血紅蛋白是紅色的，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。蛋白質的提取和分離步驟1、樣品處理通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集血紅蛋白溶液。2、粗分離經過透析去除分子量較小的雜質。3、純化通過凝膠色譜法將相對分子質量大的雜質蛋白質除去。4、純度鑒定通過SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳進行鑒定。（三）SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳（選做）2.試劑的配制：鑒定血紅蛋白純度。1.目的：3.方法步驟：（略）收集得到的純化后的血紅蛋白練習鞏固：1、隨著人類跨入蛋白質組時代，對蛋白質的研究和應用越來越深入，首先要做的一步是（）A弄清各種蛋白質的空間結構B弄清各種蛋白質的功能C弄清各種蛋白質的