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DB34DB34/T3308—2018兩系雜交水稻種子純度檢測分子標記法Protocolforpuritydetectionoftwo-linehybridseeds-molecularmarkermethod2018-12-29發布2019-01-29實施安徽省市場監督管理局發布I1GB/T3543.2農作物種子檢驗規GB/T3543.5農作物種子檢驗規程真實性GB/T6682分析實驗室用水規CTAB：cetyltrimethylammoniumbromide，DNA：deoxyribonucleicaciddNTPs：deoxyribonucleosidetriphoPAGE：polyacrylamidegelelectrophoresis，聚PCR：polymerasechainreaction，聚合SSR：simplesequencere具有共顯性，雜交種子具有雙親等位標記互補帶型，針對不同品種篩選其區別于其它品種的特征SSR標記，通過SSR多態性分析，可判斷受檢種子是否為雜交種并區別正常個體與異品種個體。本標準綜合利用兩系不育基因特征標記和不同品種特征SSR標記，鑒定一定數量送驗樣品中的正常個體數目或2高壓滅菌鍋、超純水儀、高速離心機、恒溫水浴鍋（30℃~100℃)、核酸蛋白測定儀、組織研磨去離子甲酰胺、溴酚藍、二甲苯青FF、丙烯酰胺、從送檢樣品中分取規定數量的試樣，試樣采用單個個體獨立檢測。試樣的抽取應有代表性，符合試樣的檢測應設置重復，重復的次數以達到GB/T3543.5規定的容許誤差范圍內為止，每次重復取待檢樣品的去殼種子、幼苗或葉片約200～300mg置于2.0mL離心管，充分研磨；每管700μL經65℃預熱的CTAB提取液，充分混合，65℃水浴30mi棄上清液，用70％乙醇溶液洗滌2遍；室溫自然晾干后，加入超純水或T3將種子發芽至幼苗長度達到3cm左右時剪取0.5cm長的幼苗，或將田間植株的葉片剪取0.5每個兩系雜交水稻品種至少篩選2對引物進行純度鑒定，包括針對該品種不育基因類型），F:AGGCATGGTGAAGCAAAM:GAAGCAAAGAAATGCATTGTTT4擴增產物加入2L上樣指示劑后于4℃保存。涂有剝離硅烷的一面朝下蓋于無凹槽玻璃板上，兩側對稱拔下玻璃板上的樣品梳，用清水洗凈點樣槽，再將玻璃板裝上電泳槽，上下槽右，停止電泳，一次性可檢測96×2=192出，在清水中漂洗1分鐘左右；最后取出膠板，晾干，放在膠片觀察燈下觀察，56用TE緩沖液1（或超純水）分別配制正向7A.3.3親和硅烷工作液8(資料性附錄)溶液原濃

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