CN119039388B 一種動物血源抗氧化肽及其制備方法與應用 （合肥工業大學）

一種動物血源抗氧化肽及其制備方法與應用了血球蛋白中多肽的抗氧化活性機制與構效關23發與利用。并能從分子相互作用的角度解釋蛋白質和生物活性肽之間的結構與活性4NaCl和金屬離子等因素的影響下穩定性更350-1600m/Z;一級掃描中強度最高的20個離子經四極桿篩選后使用HCD裂解后進行碎片離級掃描。器https://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/預測多肽的潛在生物活性，預測主[0023]分子對接使用Autodock分析所選抗氧化肽與Keap1的相互作用；在與抗氧化肽對BIOVIADiscoveryStudio2021Client可視化軟件獲得了多肽和目標蛋白之間相互作用5[0024]分子動力學模擬是使用Gromacs2020軟件對通過分子對接獲得的蛋白質_配體復[0025]首先通過約束蛋白質以及小分子的重原子，以及對水分子進行10000步的能量最和多肽之間的結構_活性關系；實現了有高抗氧化活性的多肽快速篩選，并闡明多肽與細胞實驗不僅耗時少，成本也相對較低。本發明采用了H2O2誘導的Caco_2細胞氧化損傷模抗氧化肽預防細胞氧化應激損傷的潛在抗氧化途徑，驗證了抗氧化肽與Keap1蛋白的相互[0030](1)本發明制備方法利用益生菌協同酶解技術制備了血紅蛋白肽粗肽，與單一酶[0032](3)本發明將多肽進一步的純化鑒定，借助計算機的手段對其理化性質及活性預Keap1_Kelch區域氨基酸殘基與Nrf2形成氫鍵的2個結合位點。分子動力學模擬結果顯示，Keap1_GLWGKV和Keap1_LIVYPW兩個復合物在100ns左右均達到了動態平衡，均未脫離蛋白Keap1之間，GLWGKV與Keap1蛋白的結合自由能為_86.37kJ/mol顯著低于LIVYPW與Keap1蛋6[0033](4)本發明發現了多肽GLWGKV在模擬胃腸道消化過程中是穩定的，抗氧化活性整的預防機制。發現GLWGKV提高了H2O2誘導的氧化損傷Caco_2細胞中SOD、CAT和GSH_Px的活7[0056]為了測量水解產物受pH值的影響，使用1MHCl和1M℃)下靜置1h后進行DPPH自由基清除活性測掃描范圍：350-1600m/z;一級掃描中強度最高的20個離子(top20)經四極桿篩選后使用[0067]ToxinPred虛擬預測多肽的毒性(.in/raghava/8生物活性越高，選擇≥0.5的多肽。使用CPPpred軟件(https://distilldeep.ucd.ie/從0～1，得分越高生物可穿透性越高。使用BIOPEP_UWMTM生物活性肽數據庫(https://氧化肽與Keap1的相互作用。Keap1蛋白的晶體結構從蛋白質數據庫(PDBID:2FLU，中去除水分子和原始配體(Nrf2)，然后使用Autodock添加氫原子和電荷。使用ChemDraw視化軟件獲得了多肽和目標蛋白之間相互作用的2D和3D結[0071]使用Gromacs2020軟件對通過分子對接獲得的蛋白質_配體(Keap1_GLWGKV與Gaff2作為配體力場，選擇TIP3P水模型向蛋白質_配體體系中加入溶劑，建立周期邊界為5％CO2飽和濕度的培養箱中進行培養，每1～2d更換培養液細胞密度培養至8090％時9溫)，并在室溫下用5％脫脂牛奶封閉30min。將膜與稀釋的一抗Nrf2(1:1000)、HO_1(1:M3[0089]為了純化抗氧化肽，將富集的M1組分經過Sephadex_G25色譜柱進一步的分離純果顯示，從P1中鑒定出149條多肽。多肽的長度為6～25個氨基酸，分子量在559.34至[0093]將鑒定出149個多肽片段首先進行多肽的毒性預測，全都沒有毒性。PeptideRanker程序用于根據其結構模式(得分為>0.5)篩選潛在的生物活性物質，鑒定149個多肽性與生物可及性評分都大于0.5，其可能具有潛在的抗氧化活性并能在細胞中發揮抗氧化作用。使用BIOPEP_UWMTM數據庫將RFFASF、ASFGNL、ALARLLIVYPWTQRFF、[0095]通過計算機模擬預測篩選出2條可能根據有潛在生物活性的抗氧化肽，為了進一出與原生配體相似的結合模式(如圖5)。具體來說，GT通過與受體蛋白Keap1的Arg380、了Keap1_Kelch區域的氨基酸殘基與Nrf2形成氫鍵的6個結合位點(Arg380、Arg415、德華力等，對接的結合能為_10.85kcal/mol。LT占據了Keap1_Kelch區域的氨基酸殘基與Nrf2形成氫鍵的2個結合位點(Arg415和Arg483)。較低的對接能量表明肽和蛋白質之間的回旋半徑均有減小且達到平衡。GT與Keap1蛋白之間的氫鍵數量要明顯多于LT與Keap1之的Caco_2細胞的活力顯著增加了35.91恢復到未處理對照組的87.22同樣，LT也nano_LC_MS/MS鑒定出分別來自6種蛋白的149條多肽，肽鏈長度小于10的多肽占比達Nrf2形成氫鍵的6個結合位點，LIVYPW則占據了2個結合位點。分子動力學模擬結果顯示，Keap1_GLWGKV和Keap1_LIVYPW兩個復合物在100ns左右均達到了動態平衡，均未脫離蛋白Keap1之間，GLWGKV與Keap1蛋白的結合自由能為_86.37kJ/mol顯著低于LIVYPW與Keap1蛋多肽的抗氧化活性機制與構效關系。其方法也可拓展到抗氧化以外的功能活性的快速篩