孤獨癥全基因組陽性位點在中國漢族人群的驗證

/孤獨癥全基因組陽性位點在中國漢族人群的驗證【摘要】目的：探討孤獨癥全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)顯示關(guān)聯(lián)的陽性單核苷酸多態(tài)性位點(SNPs)在中國漢族人群中是否與孤獨癥存在關(guān)聯(lián)。方法：符合美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第4版(DSM-Ⅳ)診斷標(biāo)準(zhǔn)的孤獨癥兒童757例和成年正常對照1436例。選取既往GWAS中與孤獨癥全基因組水平顯著關(guān)聯(lián)的5個SNPs(NEGR1基因的rs1620977、CADPS基因的rs1452075、NUDT12基因附近的rs325506、COA8基因附近的rs10149470、KIZ基因附近的rs910805)和2個與既往報道陽性位點強連鎖不平衡的SNPs(MMS22L基因附近的rs9375225和MROH5基因附近的rs746839)，應(yīng)用AgenaMassARRAYSNP分型方法對SNPs進行基因分型。采用Pearson檢驗比較孤獨癥組和對照組各SNP等位基因和基因型的分布頻率，分析其與孤獨癥的關(guān)聯(lián)。結(jié)果：孤獨癥組NEGR1基因的rs1620977基因型和等位基因A的頻率(病例vs.對照：17.2%vs.14.3%)和MROH5基因附近的rs746839的攜帶等位基因G的基因型頻率(病例vs.對照：31.4%vs.26.0%)及G等位基因的頻率(病例vs.對照：17，2%vs.14.3%)均高于正常對照組(P＜0.05)，且在男性中兩組差異經(jīng)Bonferroni校正后仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.007)。結(jié)論：中國漢族人群中NEGR1基因的rs1620977和MROH5基因附近的rs746839與孤獨癥關(guān)聯(lián)，可能是孤獨癥的易感位點。【關(guān)鍵詞】孤獨癥；單核苷酸多態(tài)性；病例對照關(guān)聯(lián)研究；NEGR1基因 孤獨癥是孤獨癥譜系障礙(autismspectrumdisorder，ASD)中最嚴(yán)重、最典型的一種神經(jīng)發(fā)育障礙，臨床主要表現(xiàn)為社會交往損害、語言和非語言交流障礙、重復(fù)刻板行為和興趣范圍狹窄。全球ASD的患病率約為1%，其中男女比例約為4∶1[1]。家系及雙生子等研究提示遺傳因素在ASD的病因中發(fā)揮重要作用[2]，該病遺傳度高達80%～93%[2-3]。常見變異是ASD遺傳風(fēng)險的重要部分，其中單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)遺傳風(fēng)險約為50%[3]。既往歐洲人群ASD全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wideassociationstudy，GWAS)發(fā)現(xiàn)位于CDH10、MSNP1AS、GPC6等基因的SNPs與ASD顯著關(guān)聯(lián)，且MSNP1AS基因附近的rs4307059等位點在中國漢族人群中也是孤獨癥的易感位點，提示部分遺傳位點可能在不同種族中均參與孤獨癥的發(fā)病[4-6]。最新ASD大樣本GWAS發(fā)現(xiàn)多個全基因組水平顯著關(guān)聯(lián)的陽性位點，且均為該研究首次報道與孤獨癥關(guān)聯(lián)，但這些位點與中國漢族人群孤獨癥是否關(guān)聯(lián)尚不清楚。 因此本研究選取GWAS中與ASD關(guān)聯(lián)的5個陽性位點以及2個與陽性位點強連鎖不平衡的SNPs進行研究，探討上述位點在中國人群中是否與孤獨癥存在關(guān)聯(lián)。 1對象與方法 1.1對象及樣本量 孤獨癥組：來源于2014年1月—2019年10月北京大學(xué)第六醫(yī)院門診患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第4版(DiagnosticandStatisticalManualofMentalDisorders，F(xiàn)ourthEdition，DSM-IV)孤獨癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，由2名以上兒童精神科副主任醫(yī)師進行診斷；②患者及其生物學(xué)父母皆為漢族，患者年齡≤18歲，無家族性神經(jīng)精神等遺傳病史；③孤獨癥行為量表(AutismBehaviorChecklist，ABC)≥53分[8]；④兒童孤獨癥評定量表(ChildhoodAutismRatingScale，CARS)≥36分[8]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患阿斯伯格綜合征(Aspergersyndrome)或未特定廣泛性發(fā)育障礙(pervasivedevelopmentaldisorder-nototherwisespecified，PDD-NOS)；②患苯丙酮尿癥、脆性X染色體綜合征、結(jié)節(jié)性硬化或其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病；③患嚴(yán)重軀體疾病；④攜帶異常染色體核型。 正常對照組：同期于北京大學(xué)第六醫(yī)院招募成年正常對照。入組標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～35歲；②正常對照及其生物學(xué)父母皆為漢族。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有神經(jīng)、精神和嚴(yán)重軀體疾病；②有家族性遺傳病史。 采用Quanto1.2.4軟件估算樣本量。孤獨癥患者與正常對照比例為1：2；孤獨癥全球患病率約為1%，設(shè)定人群風(fēng)險為0.01[1]；依據(jù)所選取SNPs在中國漢族基因組數(shù)據(jù)庫()的最小等位基因頻率(minorallelefrequency，MAF)，設(shè)定等位基因頻率為0.13～0.43；根據(jù)既往文獻設(shè)定遺傳效應(yīng)值為1.3～1.5[9-10]；Ⅰ類錯誤概率P＜0.05(雙側(cè))；當(dāng)power為0.8時，估算樣本量為孤獨癥組680例，對照組1300例以上。 本研究共納入757例中國漢族孤獨癥患者(男性665例，女性92例)，1436例中國漢族正常對照(男性1273例，女性163例)，2組性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(=0.31，P＞0.05)。患者年齡中位數(shù)4.8(3.0，16.7)歲。 本研究獲北京大學(xué)第六醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)；所有對象均詳細了解本研究的目的和內(nèi)容，并簽署知情同意書；孤獨癥患者由其法定監(jiān)護人簽署知情同意書。 1.2工具 1.2.1孤獨癥行為評定量表-ABC[8]180-184 用于評定孤獨癥癥狀，由描述孤獨癥兒童的感覺、情緒、行為和語言等方面異常表現(xiàn)的57個條目組成。各條目評分按在量表中的負荷大小分別評為1、2、3、4分。得分越高表示孤獨癥行為程度更嚴(yán)重。孤獨癥篩查界限分為53分[8]。 1.2.2兒童孤獨癥評定量表-CARS[8]180-184 用于評估孤獨癥兒童行為表現(xiàn)異常程度，包含15個條目，每個條目共設(shè)定4級：與年齡相當(dāng)?shù)男袨楸憩F(xiàn)、輕度異常、中度異常和嚴(yán)重異常，對應(yīng)評分分別為1、2、3、4分。總分≥36分時評為重度孤獨癥，總分30～35分時評為輕～中度孤獨癥，總分＜30分則評為非孤獨癥[8]。 1.3樣本處理和SNPs基因型檢測 1.3.1樣本DNA提取 所有研究對象抽取外周靜脈血5mL。采用Qiagen公司血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA，質(zhì)檢合格后保存于-20℃冰箱。 1.3.2SNPs位點的選擇、引物設(shè)計及基因分型 在PubMed(/pubmed)和GWAScatalog(http://www.ebi.ac.uk/gwas)搜索孤獨癥/孤獨癥譜系障礙相關(guān)GWAS文獻，挑選在中國漢族人群中尚未進行研究的12個GWAS關(guān)聯(lián)位點。參考中國漢族基因組數(shù)據(jù)庫，挑選在中國漢族人群中MAF＞0.05的SNPs位點。參考精神病基因組學(xué)聯(lián)盟數(shù)據(jù)庫(/pgc/data)，挑選與ASD關(guān)聯(lián)的位點(P＜0.05)。最終選取7個ASD全基因組水平顯著關(guān)聯(lián)的SNPs(NEGR1基因的rs1620977、CADPS基因的rs1452075、NUDT12基因附近的rs325506、MMS22L基因附近的rs2388334、MROH5基因附近的rs11787216、COA8基因附近的rs10149470和KIZ基因附近的rs910805)進行研究[11]。 用AgenaBioscience在線軟件(/Home)進行多重PCR引物設(shè)計。其中2個SNPs(rs2388334和rs11787216)引物與其他SNPs引物不兼容，故采用Haploview4.2軟件分析后選取物理位置較近的強連鎖不平衡位點rs9375225和rs746839進行基因分型。采用AgenaBioscience基因分型試劑盒進行擴增產(chǎn)物制備后經(jīng)AgenaBioscience質(zhì)譜儀檢測及SNPs基因分型。 1.4統(tǒng)計方法 采用Quanto軟件計算統(tǒng)計功效，SPSS24.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布采用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)進行統(tǒng)計描述，不符合正態(tài)分布則采用中位數(shù)(最小值，最大值)進行統(tǒng)計描述。采用擬合優(yōu)度檢驗判定SNPs基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡(Hardy-Weinbergequilibrium，HWE)。采用Pearson檢驗計算兩組間基因型和等位基因的分布是否存在差異，P值均為雙側(cè)性。采用Bonferroni方法對P值進行多重檢驗校正，顯著性P值設(shè)定為0.007(P＜α/n=0.05/7=0.007)。 2結(jié)果 2.1質(zhì)量控制 7個SNPs的基因分型結(jié)果聚類清晰，所有位點的分型成功率均＞97.8%。所有位點的統(tǒng)計功效在0.83～0.98之間。正常對照中所有SNPs基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)(表1)。 2.2孤獨癥組和對照組7個SNPs基因型分布頻率比較 NEGR1基因的rs1620977攜帶等位基因A的基因型(AA+AG)孤獨癥組頻率高于正常對照組(30.4%vs26.3%，P＜0.05)，經(jīng)Bonferroni校正后結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。孤獨癥組MROH5基因附近的rs746839攜帶等位基因G的基因型(GC+GG)頻率高于正常對照組(31.4%vs26.0%，P＜0.05)，且在男性樣本中差異經(jīng)Bonferroni校正后仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.007)(表2)。 2.3孤獨癥組和對照組7個SNPs等位基因分布頻率比較 孤獨癥組NEGR1基因的rs1620977等位基因A頻率高于正常對照組(17.2%vs14.3%，P＜0.05)，且在男性樣本中差異經(jīng)Bonferroni校正后仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.007)(表3)。MROH5基因附近的rs746839等位基因G在孤獨癥組頻率高于正常對照組(17.2%vs14.3%，P＜0.05)，且在男性樣本中差異經(jīng)Bonferroni校正后仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.007)(表3)。 3討論 本研究探索孤獨癥全基因組水平顯著關(guān)聯(lián)SNPs與中國漢族孤獨癥的關(guān)聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于NEGR1基因的rs1620977和MROH5基因附近的rs746839與中國漢族孤獨癥關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn)孤獨癥組rs1620977攜帶A等位基因的基因型(AG+AA)和A等位基因及rs746839攜帶等位基因G的基因型(GC+GG)和G等位基因的頻率高于對照組，且在男性樣本中后三者的差異經(jīng)Bonferroni多重檢驗校正后仍有統(tǒng)計學(xué)意義。 本研究發(fā)現(xiàn)在男性孤獨癥群體中rs1620977和rs746839攜帶風(fēng)險等位基因的基因型和風(fēng)險等位基因頻率更高。既往研究在男性ASD患者家系中發(fā)現(xiàn)新的與孤獨癥連鎖的染色體區(qū)域[12]。此外，部分基因的新生突變在神經(jīng)發(fā)育障礙的男性中富集[13]。本研究及既往研究均提示，孤獨癥男性可能對某些致病因素更為易感或富集某些致病因素。 注：SNP，單核苷酸多態(tài)性。 本研究發(fā)現(xiàn)在中國漢族人群中rs1620977與孤獨癥關(guān)聯(lián)，這與既往研究在歐洲人群中ASD和重度抑郁障礙GWAS的meta分析發(fā)現(xiàn)rs1620977達到全基因組水平顯著關(guān)聯(lián)一致[11]。此外，另有研究發(fā)現(xiàn)rs1620977與正常人的受教育程度和認知能力關(guān)聯(lián)[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)的孤獨癥關(guān)聯(lián)位點rs746839，在精神病基因組學(xué)聯(lián)盟對8種精神疾病的meta研究中與ASD和精神分裂癥關(guān)聯(lián)[16]。此外，Grove等人的GWASmeta分析發(fā)現(xiàn)rs11787216在全基因組水平與ASD及歐洲人群受教育程度顯著關(guān)聯(lián)[12]，該SNP位點與本研究的rs746839物理位置接近且存在強連鎖不平衡(B4AG263.jpg=0.92)。上述研究結(jié)果均提示在歐洲人群及漢族人群中NEGR1基因的rs1620977和MROH5基因附近的rs746839與孤獨癥等神經(jīng)發(fā)育疾病或相關(guān)特征關(guān)聯(lián)。 本研究發(fā)現(xiàn)NEGR1基因的rs1620977與孤獨癥關(guān)聯(lián)。NEGR1基因位于染色體1p31.1區(qū)域，可編碼神經(jīng)生長調(diào)節(jié)蛋白1。Braineac數(shù)據(jù)庫()顯示rs1620977是NEGR1基因的順式作用表達數(shù)量性狀基因座，可能影響該基因的表達水平。GWASCatalog數(shù)據(jù)庫表明NEGR1基因的部分SNPs與神經(jīng)精神疾病及孤獨癥相關(guān)特征顯著關(guān)聯(lián)。有研究發(fā)現(xiàn)位于NEGR1基因的rs7531118與孤獨癥和精神分裂癥關(guān)聯(lián)[16]。此外，有研究報道1例男孩染色體1p31.1-p31.3區(qū)域存在約6.5Mb的缺失，導(dǎo)致NEGR1等20個基因缺失；該男孩具有注意缺陷、智力障礙及語言障礙等孤獨癥相關(guān)臨床表現(xiàn)[17]。另有研究發(fā)現(xiàn)一對同胞姐弟存在1p31.1染色體區(qū)域約315kb的拷貝數(shù)缺失，導(dǎo)致NEGR1基因部分缺失；此姐弟皆患有注意缺陷多動障礙伴發(fā)育障礙，且弟弟具有社交技能和交流能力缺陷等孤獨癥相關(guān)臨床表現(xiàn)[18]。 功能研究發(fā)現(xiàn)NEGR1基因可調(diào)節(jié)神經(jīng)突生長和樹突棘密度[19-20]。下調(diào)小鼠腦內(nèi)NEGR1基因發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元遷移異常，而ASD患者和相應(yīng)動物模型均存在神經(jīng)元皮層發(fā)育異常[20]。下調(diào)NEGR1基因表達或敲除NEGR1基因的小鼠出現(xiàn)社交能力和學(xué)習(xí)能力受損等ASD相關(guān)的行為表現(xiàn)[20-21]。上述研究提示NEGR1基因可能是ASD的易感基因，參與孤獨癥發(fā)病。 本研究發(fā)現(xiàn)孤獨癥GWAS陽性位點NEGR1基因的rs162097