CN116179571B 通過改造林可鏈霉菌slcg-2185基因提高林可霉素產量的方法及應用 （安徽大學）

頁.通過改造林可鏈霉菌SLCG_2185基因提高林本發明提供了一種通過改造林可鏈霉菌SLCG_2185基因提高林可霉素產量的方法，通過基因工程途徑使林可鏈霉菌中過表達FadR家族轉錄調控基因SLCG_2185，獲得林可霉素高產工程菌株，用所得菌株發酵生產林可霉素；所述SLCG_2185基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本發明還提供了一種通過改造林可鏈霉菌SLCG_2185基因提高林可霉素產量的方法的應SLCG_2185，通過基因工程途徑過表達林可鏈霉菌染色體上SLCG_2185基因拷貝，能夠獲得林可21.一種通過改造林可鏈霉菌SLCG_2185基因提高林可霉素產量的方法，其特征在于，通過基因工程途徑使林可鏈霉菌LA219X中過表達FadR家族轉錄調控基因SLCG_2185，獲得2.根據權利要求1所述的通過改造林可鏈霉菌SLCG_2185基因提高林可霉素產量的方3.根據權利要求1所述的通過改造林可鏈霉菌SLCG_2185基因提高林可霉素產量的方4.一種SLCG_2185基因改造型林可鏈霉菌的應用，其特征在于，一所述方法中構建得到的SLCG_2185基因改造型林可鏈霉菌用于林3通過改造林可鏈霉菌SLCG_2185基因[0001]本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及一種通過改造林可鏈霉菌SLCG_2185基林霉素具有極大的藥用價值，是少數幾個在臨床上用于治療革蘭陰性厭氧菌的藥物之一。中FadR家族調控因子WhiH可以調控氣生菌絲的分離和孢子形成；SCO1678可以調控放線紫紅素的生物合成。這暗示著FadR家族可能對其他鏈霉菌抗生素的生物合成也有重要作用，4[0006]本發明所要解決的技術問題在于提供一種通過改造林可鏈霉菌SLCG_2185基因提[0008]一種通過改造林可鏈霉菌SLCG_2185基因提高林可霉素產量的方法，通過基因工程途徑使林可鏈霉菌中過表達FadR家族轉錄調控基因SLCG_2185，獲得林可霉素高產工程[0009]作為本發明的優選方式之一，所述SLCG_2185基因編碼的氨基酸序列如SEQID[0010]作為本發明的優選方式之一，所述SLCG_2185基因產物正向調控林可霉素生物合[0011]一種上述通過改造林可鏈霉菌SLCG_2185基因提高林可霉素產量的方法的應用：在林可鏈霉菌工業高產菌株LA219X中過表達FadR家族調控基因SLCG_2185，獲得高產突變[0013]本發明研究中篩選到了林可霉素生物合成正調控子SLCG_2185，通過基因工程途[0014]林可鏈霉菌LCGL中過表達SLCG_2185基因時林可霉素產量提高了14.6而ΔSLCG_2185缺失突變株林可霉素產量降低20.2表明SLCG_2185是一個參與林可霉素生物表達SLCG_2185基因，使林可霉素產量提高了17.8說明過表達SLCG_2185基因提高林可5[0022]圖8是SLCG_2185基因對菌株形態分化的影響及ΔSLCGL_2185突變株生物量的測[0024]圖10是林可霉素工業高產菌株LA219X、LA219X/pIB139_2185中林可霉素產量分株_林可鏈霉菌LCGL為林可鏈霉菌LC_G(GenBank:CP022744.1)基礎上改進獲得的菌株，具[0027]下述實施例中使用到的大腸桿菌在37℃的液體LB培養基或在添加1.25％瓊脂的在含有1.8％瓊脂的改良高氏一號(MGM物的合成和DNA測序由生工生物工程(上海)股份有限公司6789[0040]根據LCGL基因組信息可知，SLCG__2185基因長度為942bp，蛋白單體大小為HindIII酶切上下游同源臂，將酶切后片段進行膠回收并用紫外分光光度計進行DNA的定上培養20h左右長出單克隆。最后挑單克隆至液體培養基進行擴大培養并提質粒進行雙酶[0044]將獲得的pKC1139_Δ2185質粒經PEG3350介導轉化至LCGL的原生質體中，利用同約5000_8000ng與LCGL原生質體混合后加入PEG3350，將混合物涂布在R5平板30℃培養20h蓋培養基后培養至長出轉化子。挑取轉化子涂布于帶Apr抗性的工業平板上，待其長出抗[0051]將pIB139_2185質粒經PEG3350介導轉化至LA219X的原生質體中，構建LA219X/℃搖床培養48小時后，取等量的LCGL和ΔSLCGL_2185新鮮菌液于YMG培養基中，30℃,[0060]收集24h的ΔSLCG_2185和野生菌株LCGL菌液，采用全式金RNA提取試劑盒獲得所[0064]ΔSLCGL_2185在發酵培養基中發酵168h后，經HPLC檢測林可霉素產量，發現Δ[0066]為了確定SLCG_2185基因是否調控菌體的孢子形成，將突變株ΔSLCGL_2185和對[0068]為了進一步驗證突變體ΔSLCGL_2185中林可霉素產量的下降是由于SLCGL_2185LCGL下降20.2回復菌株ΔSLCGL_2185/pIB139_2185中林可霉素的產量恢復到LCGL中林高了17.8％(圖10)，這說明高產菌株LA219中SLCG_2185基因同樣參與調節林可霉素的產