CN116178573B 一種腸道靶向的雙菌多核凝膠顆粒及其制備方法 （沈陽農業大學）

CGMCCNO.250462022.06.10CGMCCNO.250402022.06.09release.JournalofBiomaterialsScience,PolymerEdition.2018,1643-1655.一種腸道靶向的雙菌多核凝膠顆粒及其制一種腸道靶向的雙菌多核凝膠顆粒及其制備方制備包含青春雙歧桿菌和枯草芽孢桿菌兩種菌2取1~2mL青春雙歧桿菌菌懸液于離心管中，并按5~15mg/mL的比例纖維素鈉，混勻；然后加入20~40mL濃度為20~40mg/mL的海藻酸鈉溶液和0.1~0.2gCaCO3將100~200mg羧甲基纖維素鈉溶解在20~40mL的超純水中，加入220~440mg1-乙所述青春雙歧桿菌的保藏編號為CGMCCNo.2所述枯草芽孢桿菌的保藏號為CGMCCNo.23[0003]目前，凝膠包裹被廣泛用于保護益生菌免受外部環境和胃腸道的不利條件的影在雙歧桿菌釋放后提供嚴格的厭氧環境且沒有涉及[0004]現有的包載益生菌凝膠顆粒的報道多以單腔室存儲區域的殼-核結構為主，且針[0007]將100～200mg羧甲基纖維素鈉溶解在20～40mL的超純水中，加入220～44CaCO3~40mg/mL氯化鈣溶液中，滴注時將針尖與氯化鈣溶液表面的距離控制在45-5[0018]所述青春雙歧桿菌為青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)FS2-3，且已于2022年06月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，其地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC[0022]本發明制備得到的巰基化羧甲基纖維素鈉的中巰基含量為139.02±5理30min后，雙菌多核凝膠顆粒中位于外殼中的枯草芽孢桿菌SNBS-3活菌數明顯高于位于[0025]冷凍干燥后獲得的雙菌多核凝膠顆粒粉劑中枯草芽孢桿菌和青春雙歧桿菌的活枯草芽孢桿菌SNBS-3和內芯的青春雙歧桿菌FS2-3在4℃條件下儲存90d后，存活率分別高[0031]圖5為羧甲基纖維素鈉和巰基化羧甲基纖維素鈉對腸表面的最大分離力和總粘附[0035]圖9為雙菌多核凝膠顆粒中枯草芽孢桿菌和青春雙歧桿菌在人工腸液中的活菌數6于2022年06月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏和無細胞提取物對DPPH的清除率均超過了65具有良好的還原力，還原力大小的范圍為[0040]本發明實施例中所述青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)FS2-3菌懸[0041]2、本發明實施例中所述枯草芽孢桿菌，篩選自遼寧省沈陽市采集的傳統發酵豆[0042]枯草芽孢桿菌SNBS-3對黑星病菌的抑制效果顯著，抑制率達到99.93接近100％。該菌株對南國梨黑星病和赤星病有明顯的防治效果，能顯著提高了果實品質和產[0043]本發明實施例中所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)SNBS-3菌懸液的制備方7[0046]將100～200mg羧甲基纖維素鈉溶解在20～40mL的超純水中，加入220～4[0056]本發明以青春雙歧桿菌(B.adolescentis)FS2-3為例，通過體外黏附試驗觀察分8[0062]羧甲基纖維素鈉/益生菌菌懸液制備：將10～20mg羧甲基纖維素鈉溶解在2～4mL素鈉100～200mg與1-2mL青春雙歧桿入羧甲基纖維素鈉/益生菌菌懸液和巰基化羧甲基纖維素鈉/益生菌菌懸液，以生理鹽水/益生菌菌懸液作對照，培養2h。用PBS洗2～3次，去除未黏附益生菌。再加入含1％SDS-[0069]從圖2可知，青春雙歧桿菌FS2-3對腸黏液的黏附率為7.69而添加巰基化羧甲基纖維素鈉組中該菌的黏附率高達43.67±0.42明顯高于羧甲基纖維素鈉組的黏附率[0071]取小鼠腸道鋪于無菌載玻片上，分別加入羧甲基纖維素鈉/益生菌和巰基化羧甲9[0077]本發明利用流變儀和經典拉伸實驗分析實施例1制備得到的巰基化羧甲基纖維素[0080]按50～100mg/mL將羧甲基纖維素鈉和巰基化羧甲基纖維素鈉加入等體積的腸黏率設定為1～2Hz，應變設定為0.11000測量并記錄羧甲基纖維素鈉和巰基化羧甲基[0081]從圖4可知，羧甲基纖維素鈉動態流變特性測試結果顯示(圖4a)，隨著時間的變[0083]設置拉伸試驗測量羧甲基纖維素鈉和巰基化羧甲基纖維素鈉與腸黏液的最大分[0084]從圖5可知。對比兩組數據，巰基化羧甲基纖維素鈉的最大分離力達到82.35±[0088]取1～2mL青春雙歧桿菌FS2-3菌懸液(1×108CFU/mL)于離心管中，并按5～15mg/[0090]將0.5～1ml枯草芽孢桿菌SNBS-3菌液(1×108CFU/mL)與0.5～1mL上述制得的內速逐滴擠壓入濃度為20～40mg/mL氯化鈣溶液中，滴注時將針尖與氯化鈣溶液表面的距離[0093]利用微米粒徑分析儀對實施例5制備得到的雙菌多核凝膠顆粒粒徑進行檢測，結~18mL預熱的人工胃液(質量濃度比為0.85％的NaCl溶液用0.1mol/L的HCl調節pH為1.5，多核凝膠顆粒中位于外殼中的枯草芽孢桿菌SNBS-3活菌數明顯高于位于內芯的青春雙歧[0106]上述結果表明，本發明制備得到的雙菌多核凝膠顆粒能活菌數分別為7.60×107cfu/g和為芯的青春雙歧桿菌FS2-3在4℃條件下貯藏90d后存活率高達84.10此時的活菌數為6.80×107