間歇性低氧對(duì)大鼠肺動(dòng)脈ET - 1敏感性及內(nèi)皮損傷的機(jī)制探究

間歇性低氧對(duì)大鼠肺動(dòng)脈ET-1敏感性及內(nèi)皮損傷的機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（ObstructiveSleepApneaSyndrome，OSAS）是睡眠呼吸疾病中極為常見的一種，其特征為睡眠中上氣道阻塞，頻繁出現(xiàn)呼吸不暢和呼吸中斷。流行病學(xué)調(diào)查顯示，OSAS在人群中的發(fā)病率為2％-4％，是臨床上的常見疾病，會(huì)對(duì)全身各個(gè)系統(tǒng)造成綜合性損傷。OSAS患者會(huì)出現(xiàn)周期性的動(dòng)脈血氧飽和度波動(dòng)，進(jìn)而導(dǎo)致周期性間歇性低氧（CyclicIntermittentHypoxia，CIH）。有研究指出，每天將大鼠置于間歇性低氧環(huán)境中數(shù)小時(shí)，數(shù)周后可引起持續(xù)性肺動(dòng)脈高壓以及肺血管重塑。肺動(dòng)脈高壓是一種嚴(yán)重的心血管疾病，其病理生理過程涉及血管收縮、血管重構(gòu)及原位血栓形成等，最終可導(dǎo)致右心功能衰竭和死亡。在肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展過程中，遠(yuǎn)端肺細(xì)小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖異常、膠原纖維增生、內(nèi)皮細(xì)胞功能異常等是重要的病理結(jié)構(gòu)改變。而間歇性低氧誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但相關(guān)研究證實(shí)在這一過程中，對(duì)內(nèi)皮素-1（Endothelin-1，ET-1）敏感性增強(qiáng)、內(nèi)皮功能紊亂、血管活性物質(zhì)失衡等潛在因素起到了重要作用。肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮是一個(gè)代謝極為活躍的組織，能夠合成和釋放多種血管活性物質(zhì)，如ET-1、一氧化氮（NO）等，這些物質(zhì)共同調(diào)節(jié)著血管壁的舒縮功能以及平滑肌的增殖、遷移等過程。研究認(rèn)為，間歇性低氧可能會(huì)增加血漿ET-1水平，使內(nèi)皮功能異常，血管緊張度增加，從而誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓。ET-1是一種由內(nèi)皮細(xì)胞分泌的具有強(qiáng)烈縮血管作用的多肽，在維持血管張力和心血管穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)內(nèi)皮功能受損時(shí)，ET-1的合成和釋放會(huì)發(fā)生改變，其與相應(yīng)受體的結(jié)合也會(huì)受到影響，進(jìn)而導(dǎo)致血管功能紊亂。本研究旨在利用CIH大鼠模型，通過觀察肺動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能以及對(duì)ET-1敏感性的改變，深入探討CIH對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮功能的損傷。這不僅有助于進(jìn)一步揭示肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制，為該疾病的早期診斷提供新的理論依據(jù)，還能為開發(fā)更有效的治療策略奠定基礎(chǔ)，具有重要的臨床意義。1.2研究目的與問題提出本研究旨在利用CIH大鼠模型，深入探究間歇性低氧對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮功能的損傷機(jī)制。通過系統(tǒng)觀察肺動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能以及對(duì)ET-1敏感性的改變，為揭示肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)，并為臨床治療提供潛在的靶點(diǎn)和策略。具體而言，研究目的如下：其一，明確CIH對(duì)大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響，判斷內(nèi)皮功能受損程度；其二，確定CIH是否會(huì)導(dǎo)致大鼠肺動(dòng)脈對(duì)ET-1敏感性發(fā)生改變，以及這種改變?cè)诜蝿?dòng)脈高壓形成過程中的作用；其三，分析CIH導(dǎo)致肺動(dòng)脈內(nèi)皮功能損傷的具體分子機(jī)制，如ET-1及其受體表達(dá)變化、一氧化氮（NO）生成及相關(guān)酶活性改變等。基于上述研究目的，提出以下關(guān)鍵問題：間歇性低氧如何改變大鼠肺動(dòng)脈對(duì)ET-1的敏感性？這種敏感性改變是由哪些分子機(jī)制介導(dǎo)的？?jī)?nèi)皮依賴性舒張功能在間歇性低氧條件下會(huì)出現(xiàn)怎樣的具體變化？ET-1及其受體（ETA受體和ETB受體）在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化如何，以及這些變化與內(nèi)皮功能損傷之間存在何種關(guān)聯(lián)？間歇性低氧對(duì)肺動(dòng)脈組織中NO含量及內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）表達(dá)有何影響，這些影響在肺動(dòng)脈高壓發(fā)生發(fā)展中起到何種作用？通過對(duì)這些問題的深入研究，有望全面揭示間歇性低氧誘導(dǎo)肺動(dòng)脈內(nèi)皮功能損傷的機(jī)制，為肺動(dòng)脈高壓的防治提供理論支持。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在間歇性低氧與肺動(dòng)脈高壓關(guān)系的研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了諸多成果。國(guó)外早在20世紀(jì)末就有研究關(guān)注到睡眠呼吸暫停患者中肺動(dòng)脈高壓的高發(fā)性，并指出間歇性低氧是重要的致病因素。后續(xù)大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，慢性間歇低氧（CIH）可誘導(dǎo)大鼠、小鼠等動(dòng)物出現(xiàn)肺動(dòng)脈高壓，如將大鼠置于模擬阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征的間歇性低氧環(huán)境中，數(shù)周后其肺動(dòng)脈壓力顯著升高，同時(shí)伴有右心室肥厚等典型肺動(dòng)脈高壓表現(xiàn)。國(guó)內(nèi)研究也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論，通過建立不同模式的間歇性低氧動(dòng)物模型，均觀察到肺動(dòng)脈高壓的形成，且發(fā)現(xiàn)肺動(dòng)脈高壓的程度與間歇性低氧的時(shí)間、頻率等因素相關(guān)。關(guān)于間歇性低氧與ET-1敏感性的關(guān)系，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，間歇性低氧可使肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞對(duì)ET-1的收縮反應(yīng)增強(qiáng)。有研究在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，用間歇性低氧處理肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，然后加入ET-1，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的收縮程度明顯高于正常氧環(huán)境下的細(xì)胞。國(guó)內(nèi)研究也表明，CIH大鼠肺動(dòng)脈對(duì)ET-1的敏感性增強(qiáng)，其機(jī)制可能與ET-1受體表達(dá)改變有關(guān)。通過對(duì)CIH大鼠肺動(dòng)脈組織的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ETA受體表達(dá)上調(diào)，使得肺動(dòng)脈對(duì)ET-1的收縮反應(yīng)更為敏感。在間歇性低氧與內(nèi)皮損傷方面，國(guó)外研究指出，間歇性低氧可破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞的完整性，影響內(nèi)皮細(xì)胞的功能。如一項(xiàng)研究觀察到間歇性低氧暴露后的小鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)改變、細(xì)胞連接破壞等現(xiàn)象。國(guó)內(nèi)研究則從分子機(jī)制層面進(jìn)行了深入探討，發(fā)現(xiàn)間歇性低氧可導(dǎo)致內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）表達(dá)降低，一氧化氮（NO）生成減少，從而引起內(nèi)皮功能紊亂。通過檢測(cè)CIH大鼠肺動(dòng)脈組織中eNOS蛋白表達(dá)及NO含量，證實(shí)了這一觀點(diǎn)。然而，當(dāng)前研究仍存在一些不足和空白。在間歇性低氧誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓的機(jī)制研究中，雖然已明確ET-1敏感性增強(qiáng)、內(nèi)皮損傷等因素的參與，但各因素之間的相互作用及具體信號(hào)通路尚未完全闡明。例如，ET-1與內(nèi)皮損傷之間是否存在直接的因果關(guān)系，以及通過何種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展，還需要進(jìn)一步深入研究。在研究方法上，目前多以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)為主，缺乏大規(guī)模的臨床研究來驗(yàn)證相關(guān)結(jié)論。此外，對(duì)于間歇性低氧的不同模式（如低氧時(shí)間、低氧程度、復(fù)氧時(shí)間等）對(duì)肺動(dòng)脈高壓及內(nèi)皮功能影響的差異研究較少，這也限制了對(duì)該疾病發(fā)病機(jī)制的全面理解。二、實(shí)驗(yàn)材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境本研究選用清潔級(jí)雄性SD大鼠，體重在180-200g之間，購(gòu)自[具體動(dòng)物中心名稱]。選擇雄性SD大鼠主要是基于其在心血管疾病研究中的廣泛應(yīng)用，且雄性大鼠在生理特征上相對(duì)更為穩(wěn)定，可減少因性別差異導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)誤差。SD大鼠具有遺傳背景清晰、生長(zhǎng)快、繁殖能力強(qiáng)、對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境適應(yīng)性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠更好地滿足本實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物數(shù)量和質(zhì)量的要求。大鼠購(gòu)入后，先在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。飼養(yǎng)環(huán)境溫度嚴(yán)格控制在22±2℃，此溫度范圍是大鼠較為適宜的生存溫度，能夠保證大鼠的正常生理代謝和活動(dòng)水平，避免因溫度過高或過低對(duì)大鼠的生長(zhǎng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。空氣濕度維持在50%±5%，適宜的濕度有助于保持大鼠呼吸道和皮膚的健康，防止因濕度過高引發(fā)微生物滋生，或濕度過低導(dǎo)致大鼠脫水等問題。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房采用12h光照/12h黑暗的晝夜循環(huán)節(jié)律，模擬自然環(huán)境，使大鼠的生物鐘正常運(yùn)行，從而保證其內(nèi)分泌、代謝等生理功能的穩(wěn)定性。大鼠自由進(jìn)食和飲水，飼料為標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒類動(dòng)物顆粒飼料，富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，能夠滿足大鼠生長(zhǎng)發(fā)育和維持正常生理功能的需求。飲水為經(jīng)過滅菌處理的純凈水，防止因水源污染導(dǎo)致大鼠感染疾病，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在飼養(yǎng)過程中，每天定時(shí)觀察大鼠的精神狀態(tài)、飲食、飲水及糞便情況，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并處理異常情況，確保大鼠處于良好的健康狀態(tài)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供保障。2.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑實(shí)驗(yàn)儀器方面，選用程序低氧艙來模擬間歇性低氧環(huán)境，該低氧艙能夠精確控制氧氣和氮?dú)獾妮斎氡壤瑥亩鴮?shí)現(xiàn)穩(wěn)定的低氧和復(fù)氧循環(huán)，為構(gòu)建CIH大鼠模型提供可靠的環(huán)境條件。采用離體血管灌流系統(tǒng)，用于觀察肺動(dòng)脈環(huán)的舒縮反應(yīng)，此系統(tǒng)可精確控制灌流液的成分、溫度和流速，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)血管張力的變化，為研究肺動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能及對(duì)ET-1的收縮反應(yīng)提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)。運(yùn)用RT-PCR儀進(jìn)行基因表達(dá)水平的檢測(cè)，它能夠高效、準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增特定的基因片段，通過檢測(cè)ET-1、ETA受體以及ETB受體mRNA的表達(dá)，從分子層面揭示間歇性低氧對(duì)相關(guān)基因的影響。此外，還配備了超低溫冰箱，用于儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)樣本和試劑，確保樣本的穩(wěn)定性和試劑的活性。電子天平用于準(zhǔn)確稱量大鼠體重及各種實(shí)驗(yàn)試劑，為實(shí)驗(yàn)的精確性提供保障。離心機(jī)則用于分離樣本中的不同成分，如在檢測(cè)NO含量和eNOS表達(dá)時(shí)，通過離心獲取純凈的組織勻漿上清液。光學(xué)顯微鏡和透射電鏡用于觀察肺動(dòng)脈的組織病理學(xué)變化和超微結(jié)構(gòu)的病理學(xué)變化，光學(xué)顯微鏡可清晰呈現(xiàn)組織的大體形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，透射電鏡則能深入觀察細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器和超微結(jié)構(gòu)改變，為研究?jī)?nèi)皮損傷提供直觀的形態(tài)學(xué)證據(jù)。實(shí)驗(yàn)試劑包括內(nèi)皮素-1（ET-1），它是本研究的關(guān)鍵研究對(duì)象，用于刺激肺動(dòng)脈環(huán)，觀察其收縮反應(yīng)，以探究肺動(dòng)脈對(duì)ET-1的敏感性。乙酰膽堿（ACh）用于檢測(cè)肺動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能，通過觀察ACh對(duì)預(yù)收縮肺動(dòng)脈環(huán)的舒張作用，評(píng)估內(nèi)皮功能是否受損。苯腎上腺素（PE）用于誘導(dǎo)肺動(dòng)脈環(huán)收縮，為后續(xù)觀察ACh的舒張作用和ET-1的收縮作用提供基礎(chǔ)。受體阻斷劑BQ123（ETA受體阻斷劑）和BQ788（ETB受體阻斷劑），分別用于阻斷ETA受體和ETB受體，研究ET-1與不同受體結(jié)合對(duì)肺動(dòng)脈收縮的影響。eNOS抑制劑L-NAME用于抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶的活性，觀察其對(duì)ET-1誘導(dǎo)的血管收縮的影響，進(jìn)而探討NO在其中的作用機(jī)制。RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)。免疫組織化學(xué)相關(guān)試劑，如抗體、顯色劑等，用于觀察ET-1、ETA受體和ETB受體的表達(dá)分布。WesternBlotting相關(guān)試劑，包括蛋白提取試劑、抗體、化學(xué)發(fā)光底物等，用于測(cè)定eNOS蛋白的表達(dá)。酶轉(zhuǎn)化法測(cè)定NO含量所需的試劑，如Griess試劑等，用于檢測(cè)肺動(dòng)脈組織中NO的含量。這些試劑均經(jīng)過嚴(yán)格篩選和質(zhì)量檢測(cè)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。2.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)2.3.1分組方式將適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后的清潔級(jí)雄性SD大鼠，按照完全隨機(jī)化的原則，利用隨機(jī)數(shù)字表法，隨機(jī)分為正常氧組和CIH組，每組各15只。采用完全隨機(jī)分組的方式，能夠最大程度地減少個(gè)體差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，使兩組大鼠在年齡、體重、生理狀態(tài)等方面具有可比性，從而更準(zhǔn)確地評(píng)估間歇性低氧處理對(duì)大鼠肺動(dòng)脈的影響。在分組過程中，充分考慮到樣本量的均衡性，每組設(shè)置15只大鼠，既保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有足夠的統(tǒng)計(jì)學(xué)效力，又能在實(shí)際操作中合理控制實(shí)驗(yàn)成本和時(shí)間。通過嚴(yán)格的分組操作，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。2.3.2間歇性低氧處理方案CIH組大鼠置于程序低氧艙內(nèi)，進(jìn)行每天8h，共21天的間歇低氧處理。程序設(shè)計(jì)每一低氧復(fù)氧循環(huán)時(shí)間為2min，具體設(shè)置如下：前一分鐘通過向低氧艙內(nèi)充入氮?dú)猓杆偈古搩?nèi)氧濃度降至9％，模擬低氧環(huán)境；后一分鐘充入氧氣，使氧濃度快速恢復(fù)到21％，模擬正常氧環(huán)境。如此循環(huán)往復(fù)，形成間歇性低氧刺激。這樣的低氧復(fù)氧循環(huán)設(shè)置，能夠較為真實(shí)地模擬阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征患者睡眠過程中經(jīng)歷的周期性低氧環(huán)境。每天8h的處理時(shí)間，既保證了大鼠能夠充分接受間歇性低氧刺激，又不會(huì)因過度刺激導(dǎo)致大鼠生理機(jī)能出現(xiàn)不可控的變化。持續(xù)21天的處理周期，是基于前期相關(guān)研究以及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的，該周期能夠使大鼠在間歇性低氧環(huán)境下，逐漸出現(xiàn)肺動(dòng)脈內(nèi)皮功能損傷以及對(duì)ET-1敏感性改變等相關(guān)變化，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)提供穩(wěn)定且明顯的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。正常氧組大鼠則置于同樣的艙內(nèi)，但予以空氣供氣，始終保持正常的氧濃度環(huán)境，作為對(duì)照，用于對(duì)比分析間歇性低氧處理對(duì)大鼠肺動(dòng)脈的特異性影響。2.4檢測(cè)指標(biāo)與方法2.4.1肺動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能檢測(cè)在完成間歇性低氧處理21天后，迅速將各組大鼠用10%水合***醛按0.3-0.4ml/100g體重的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉。麻醉成功后，立即在無菌條件下打開胸腔，小心取出肺動(dòng)脈，迅速置于預(yù)冷的Krebs-Henseleit（K-H）液中。K-H液成分包括（mmol/L）：NaCl118.3、KCl4.7、CaCl?2.5、MgSO?1.2、KH?PO?1.2、NaHCO?25.0、葡萄糖11.1，用前以95%O?和5%CO?混合氣體充分飽和，使其pH值維持在7.35-7.45之間。將肺動(dòng)脈小心剪成長(zhǎng)約3-4mm的血管環(huán)，正常氧大鼠肺動(dòng)脈環(huán)隨機(jī)分為內(nèi)皮完整組和去內(nèi)皮組。去內(nèi)皮組采用輕柔的機(jī)械擦拭法去除內(nèi)皮，即將血管環(huán)用鑷子輕輕夾住，在濾紙上來回輕擦3-4次，然后將血管環(huán)置于K-H液中備用。采用離體血管灌流技術(shù)，將血管環(huán)安裝在離體血管灌流系統(tǒng)的張力換能器上，一端固定，另一端連接張力換能器，以監(jiān)測(cè)血管張力的變化。將灌流系統(tǒng)充滿K-H液，保持溫度在37±0.5℃，持續(xù)通入95%O?和5%CO?混合氣體，以維持灌流液的氧含量和pH值穩(wěn)定。先給予血管環(huán)一個(gè)初始負(fù)荷，使其達(dá)到穩(wěn)定的基礎(chǔ)張力，一般為1-2g。穩(wěn)定30-60min后，用苯腎上腺素（PE）以10??mol/L的濃度加入灌流液中，誘導(dǎo)肺動(dòng)脈環(huán)收縮，待收縮達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后，記錄此時(shí)的張力值。然后，以累積濃度遞增的方式加入乙酰膽堿（ACh），其濃度依次為10??、10??、10??、10??、10??mol/L，每次加入ACh后，等待3-5min，待血管舒張反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)定后，記錄張力值。以ACh誘導(dǎo)的舒張百分比作為評(píng)估內(nèi)皮依賴性舒張功能的指標(biāo)，計(jì)算公式為：舒張百分比=（收縮前張力-加入ACh后的張力）/（收縮前張力-基礎(chǔ)張力）×100%。通過比較正常氧內(nèi)皮完整組、正常氧去內(nèi)皮組以及CIH組肺動(dòng)脈環(huán)對(duì)ACh的舒張反應(yīng)，判斷CIH對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響。2.4.2ET-1對(duì)肺動(dòng)脈收縮作用及相關(guān)影響檢測(cè)將上述制備好的各組肺動(dòng)脈環(huán)，按照與檢測(cè)內(nèi)皮依賴性舒張功能相同的方法，安裝在離體血管灌流系統(tǒng)上，穩(wěn)定基礎(chǔ)張力后。先加入PE使肺動(dòng)脈環(huán)達(dá)到穩(wěn)定的收縮狀態(tài)，記錄此時(shí)的張力值。然后，以累積濃度遞增的方式加入內(nèi)皮素-1（ET-1），其濃度依次為10?11、10?1?、10??、10??、10??mol/L，每次加入ET-1后，等待3-5min，待血管收縮反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)定后，記錄張力值。繪制ET-1濃度-收縮反應(yīng)曲線，以半最大效應(yīng)濃度（EC??）來表示肺動(dòng)脈對(duì)ET-1的敏感性，EC??值越小，表明肺動(dòng)脈對(duì)ET-1的敏感性越高。為了進(jìn)一步研究ET-1對(duì)肺動(dòng)脈收縮作用的受體機(jī)制，在加入ET-1前，分別用ETA受體阻斷劑BQ123（10??mol/L）和ETB受體阻斷劑BQ788（10??mol/L）對(duì)肺動(dòng)脈環(huán)進(jìn)行預(yù)處理30min。然后按照上述方法加入PE和ET-1，觀察并記錄血管的收縮反應(yīng)。比較不同組在受體阻斷劑作用下對(duì)ET-1收縮反應(yīng)的變化，分析ETA受體和ETB受體在ET-1誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈收縮中的作用。同時(shí)，為探究一氧化氮（NO）在ET-1誘導(dǎo)血管收縮中的作用，在加入ET-1前，用eNOS抑制劑L-NAME（10??mol/L）對(duì)肺動(dòng)脈環(huán)進(jìn)行預(yù)處理30min。然后按照相同步驟加入PE和ET-1，觀察并記錄血管的收縮反應(yīng)。對(duì)比正常氧內(nèi)皮完整組、去內(nèi)皮組以及CIH組在L-NAME處理前后對(duì)ET-1收縮反應(yīng)的差異，分析NO對(duì)ET-1誘導(dǎo)血管收縮的影響。2.4.3組織學(xué)檢測(cè)在完成各項(xiàng)功能檢測(cè)后，取部分肺動(dòng)脈組織用于組織學(xué)檢測(cè)。將肺動(dòng)脈組織用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，固定時(shí)間為24-48h。固定后的組織經(jīng)過梯度酒精脫水，依次用70%、80%、90%、95%、100%的酒精浸泡，每個(gè)濃度浸泡時(shí)間為1-2h。脫水后的組織用二甲苯透明，然后用石蠟包埋，制成石蠟切片，切片厚度為4-5μm。對(duì)石蠟切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，具體步驟如下：將切片放入蘇木精染液中染色3-5min，使細(xì)胞核染成藍(lán)色；然后用自來水沖洗，去除多余的蘇木精染液；接著將切片放入1%鹽酸酒精溶液中分化3-5s，使細(xì)胞核顏色清晰；再用自來水沖洗返藍(lán)；最后將切片放入伊紅染液中染色1-2min，使細(xì)胞質(zhì)染成紅色。染色后的切片用梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察肺動(dòng)脈組織的病理學(xué)變化，包括內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)、排列，平滑肌細(xì)胞的增生情況，以及血管壁的厚度、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等。另取部分肺動(dòng)脈組織用于透射電鏡觀察。將組織切成1mm3左右的小塊，迅速放入2.5%戊二醛溶液中固定2-4h。固定后的組織用0.1mol/L磷酸緩沖液（PBS，pH7.4）沖洗3次，每次15min。然后用1%鋨酸溶液固定1-2h，再用PBS沖洗3次。經(jīng)過梯度酒精脫水和丙酮置換后，用環(huán)氧樹脂包埋。用超薄切片機(jī)將包埋好的組織切成50-70nm的超薄切片，將切片撈在銅網(wǎng)上，用醋酸鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行雙重染色。在透射電鏡下觀察肺動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)的病理學(xué)變化，如內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞器形態(tài)、細(xì)胞膜完整性，線粒體的形態(tài)和嵴的結(jié)構(gòu)，以及細(xì)胞間連接等。2.4.4分子生物學(xué)檢測(cè)采用RT-PCR技術(shù)測(cè)定ET-1、ETA受體、ETB受體mRNA的表達(dá)。取適量肺動(dòng)脈組織，加入Trizol試劑，按照試劑說明書的步驟提取總RNA。用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度，要求A???/A???比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)GenBank中大鼠ET-1、ETA受體、ETB受體以及內(nèi)參基因β-actin的基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物。引物序列如下：ET-1上游引物5'-[具體序列1]-3'，下游引物5'-[具體序列2]-3'；ETA受體上游引物5'-[具體序列3]-3'，下游引物5'-[具體序列4]-3'；ETB受體上游引物5'-[具體序列5]-3'，下游引物5'-[具體序列6]-3'；β-actin上游引物5'-[具體序列7]-3'，下游引物5'-[具體序列8]-3'。PCR反應(yīng)體系為25μl，包括10×PCR緩沖液2.5μl，dNTPs（2.5mmol/L）2μl，上下游引物（10μmol/L）各0.5μl，TaqDNA聚合酶0.25μl，cDNA模板1μl，ddH?O補(bǔ)足至25μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以目的基因與內(nèi)參基因β-actin條帶灰度值的比值表示目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。采用免疫組織化學(xué)法觀察ET-1、ETA受體和ETB受體的蛋白表達(dá)分布。將肺動(dòng)脈組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液浸泡10-15min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。然后用PBS沖洗3次，每次5min。將切片放入枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）中，進(jìn)行抗原修復(fù)，可采用微波修復(fù)或高壓修復(fù)的方法。修復(fù)后的切片自然冷卻，用PBS沖洗3次。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20-30min，以減少非特異性染色。傾去封閉液，不洗，直接滴加一抗（ET-1、ETA受體、ETB受體的一抗，稀釋度根據(jù)抗體說明書確定），4℃孵育過夜。次日取出切片，用PBS沖洗3次，每次5min。滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30min。再用PBS沖洗3次，每次5min。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30min。用PBS沖洗3次，每次5min。最后用DAB顯色液顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)目的蛋白顯色清晰時(shí)，用自來水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，自來水沖洗返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察ET-1、ETA受體和ETB受體蛋白在肺動(dòng)脈組織中的表達(dá)分布情況，包括在內(nèi)皮層、平滑肌層等部位的表達(dá)強(qiáng)度和定位。運(yùn)用WesternBlotting技術(shù)測(cè)定eNOS蛋白的表達(dá)。取肺動(dòng)脈組織，加入適量的蛋白裂解液，在冰上充分勻漿，然后4℃、12000rpm離心15-20min，取上清液作為總蛋白提取物。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5-10min。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳條件根據(jù)凝膠濃度和蛋白分子量大小進(jìn)行調(diào)整，一般采用8%-12%的分離膠和5%的濃縮膠。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)移條件為恒流200-300mA，轉(zhuǎn)移時(shí)間1-2h。將PVDF膜放入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫封閉1-2h，以減少非特異性結(jié)合。封閉后的膜用TBST緩沖液沖洗3次，每次5min。然后將膜與eNOS一抗（稀釋度根據(jù)抗體說明書確定）孵育，4℃過夜。次日取出膜，用TBST緩沖液沖洗3次，每次5min。再將膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育，室溫孵育1-2h。用TBST緩沖液沖洗3次，每次5min。最后用化學(xué)發(fā)光底物孵育PVDF膜，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光、顯影，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以eNOS蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白（如β-actin）條帶灰度值的比值表示eNOS蛋白的相對(duì)表達(dá)量。采用酶轉(zhuǎn)化法測(cè)定肺動(dòng)脈組織中NO的含量。取適量肺動(dòng)脈組織，加入預(yù)冷的生理鹽水，在冰上充分勻漿，然后4℃、12000rpm離心10-15min，取上清液。按照NO檢測(cè)試劑盒的操作說明，將上清液與試劑盒中的試劑進(jìn)行反應(yīng)。一般先將上清液與Griess試劑混合，室溫孵育10-15min，使NO代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽與Griess試劑中的對(duì)氨基苯磺酸和N-（1-萘基）-乙二胺鹽酸鹽發(fā)生重氮化反應(yīng)，生成紫紅色偶氮化合物。然后用酶標(biāo)儀在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中NO的含量。2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析。對(duì)于所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，首先運(yùn)用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)判斷其是否符合正態(tài)分布。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的形式表示。在組間比較方面，若僅涉及兩組比較，且數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布、方差齊性，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；若方差不齊，則采用校正的t檢驗(yàn)。例如，在比較正常氧組和CIH組大鼠肺動(dòng)脈對(duì)ET-1的半最大效應(yīng)濃度（EC??）時(shí)，若數(shù)據(jù)滿足上述條件，可使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)來確定兩組之間是否存在顯著差異。當(dāng)涉及多組比較時(shí)，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）。若方差齊性，進(jìn)一步使用LSD法（最小顯著差異法）進(jìn)行組間兩兩比較；若方差不齊，則使用Dunnett'sT3等方法進(jìn)行兩兩比較。在分析不同組（正常氧內(nèi)皮完整組、正常氧去內(nèi)皮組、CIH組）在不同處理（如受體阻斷劑、eNOS抑制劑處理）下對(duì)ET-1收縮反應(yīng)的差異時(shí)，就需要運(yùn)用單因素方差分析及相應(yīng)的兩兩比較方法。對(duì)于血管舒張百分比、收縮率等百分比數(shù)據(jù)，先進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換，使其更符合正態(tài)分布的特征，再進(jìn)行上述統(tǒng)計(jì)分析。在分析ACh誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈環(huán)舒張百分比時(shí)，先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。以P<0.05作為判斷差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。若P值小于0.05，則認(rèn)為組間差異顯著，提示實(shí)驗(yàn)因素對(duì)觀測(cè)指標(biāo)產(chǎn)生了實(shí)質(zhì)性影響；若P值大于等于0.05，則認(rèn)為組間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明實(shí)驗(yàn)因素對(duì)觀測(cè)指標(biāo)的影響不明顯。通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計(jì)分析方法，確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，為深入探討間歇性低氧對(duì)大鼠肺動(dòng)脈ET-1敏感性及內(nèi)皮損傷的影響提供有力的數(shù)據(jù)支持。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1間歇性低氧對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響通過離體血管灌流技術(shù)，對(duì)正常氧組和CIH組大鼠肺動(dòng)脈環(huán)進(jìn)行檢測(cè)，觀察乙酰膽堿（ACh）對(duì)苯腎上腺素（PE）預(yù)收縮產(chǎn)生的舒張效應(yīng)。結(jié)果顯示，CIH肺動(dòng)脈環(huán)ACh對(duì)PE預(yù)收縮產(chǎn)生的舒張效應(yīng)為（53.3±4.31）％（n=6），而正常氧內(nèi)皮完整組的舒張效應(yīng)高達(dá)（93.3±4.30）％（n=6）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組數(shù)據(jù)差異具有極顯著性（P<0.01），表明CIH組大鼠肺動(dòng)脈對(duì)ACh的舒張反應(yīng)明顯低于正常氧內(nèi)皮完整組，說明間歇性低氧顯著削弱了肺動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能。與正常氧去內(nèi)皮組相比，CIH組的舒張效應(yīng)明顯更高，正常氧去內(nèi)皮組的舒張效應(yīng)僅為（3.03±2.52）％（n=6），兩組差異同樣具有極顯著性（P<0.01）。這表明CIH組雖然內(nèi)皮依賴性舒張功能受損，但仍保留了一定的舒張能力，與去內(nèi)皮后幾乎無舒張反應(yīng)形成對(duì)比。正常氧去內(nèi)皮組由于去除了內(nèi)皮細(xì)胞，失去了內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放的舒張因子的作用，所以ACh對(duì)其預(yù)收縮的舒張效應(yīng)極低。而CIH組盡管內(nèi)皮功能受損，但內(nèi)皮細(xì)胞依然存在，還能在一定程度上對(duì)ACh做出反應(yīng)，釋放舒張因子，只是這種反應(yīng)能力較正常氧內(nèi)皮完整組明顯下降。這一系列數(shù)據(jù)清晰地揭示了間歇性低氧對(duì)大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能的損傷作用。3.2間歇性低氧對(duì)ET-1誘導(dǎo)肺動(dòng)脈收縮的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠肺動(dòng)脈對(duì)ET-1誘導(dǎo)的收縮呈現(xiàn)出典型的劑量依賴性增強(qiáng)趨勢(shì)。隨著ET-1濃度從10?11mol/L逐漸遞增至10??mol/L，肺動(dòng)脈的收縮程度不斷加劇。在正常氧內(nèi)皮完整的情況下，肺動(dòng)脈環(huán)對(duì)ET-1的半最大效應(yīng)濃度（EC??）為0.718±0.008nM（n=4）。而當(dāng)去除內(nèi)皮后，肺動(dòng)脈對(duì)ET-1的敏感性顯著增強(qiáng)，其EC??降至0.493±0.004nM（n=4），與正常氧內(nèi)皮完整組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。這表明內(nèi)皮細(xì)胞在調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈對(duì)ET-1的敏感性中發(fā)揮著重要作用，去除內(nèi)皮后，失去了內(nèi)皮細(xì)胞釋放的舒張因子等的調(diào)節(jié)作用，使得肺動(dòng)脈對(duì)ET-1的收縮反應(yīng)更為敏感。CIH組大鼠肺動(dòng)脈對(duì)ET-1的敏感性同樣增強(qiáng)，其EC??為0.575±0.003nM（n=4），與正常氧內(nèi)皮完整組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。這清晰地表明間歇性低氧處理能夠顯著提高大鼠肺動(dòng)脈對(duì)ET-1的敏感性。進(jìn)一步對(duì)比CIH組與去內(nèi)皮組，發(fā)現(xiàn)去內(nèi)皮組肺動(dòng)脈環(huán)對(duì)ET-1誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)更為敏感，兩組之間差異具有極顯著性（P<0.01）。這提示盡管間歇性低氧會(huì)增強(qiáng)肺動(dòng)脈對(duì)ET-1的敏感性，但與完全去除內(nèi)皮的情況相比，其敏感性增強(qiáng)程度仍有差異，說明除了內(nèi)皮損傷外，可能還有其他因素參與了間歇性低氧對(duì)肺動(dòng)脈ET-1敏感性的調(diào)節(jié)。這些結(jié)果充分表明，間歇性低氧可使大鼠肺動(dòng)脈對(duì)ET-1的敏感性發(fā)生改變，這種改變?cè)诜蝿?dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展過程中可能起到關(guān)鍵作用。3.3ET受體阻斷劑對(duì)ET-1誘導(dǎo)肺動(dòng)脈環(huán)收縮作用的影響研究進(jìn)一步探究了ET受體阻斷劑對(duì)ET-1誘導(dǎo)的各組肺動(dòng)脈環(huán)收縮作用的影響。結(jié)果顯示，對(duì)于不同組的大鼠肺動(dòng)脈環(huán)，BQ123（ETA受體阻斷劑）展現(xiàn)出幾乎完全阻斷ET-1誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈收縮的能力。在正常氧內(nèi)皮完整的大鼠肺動(dòng)脈中，BQ788（ETB受體阻斷劑）對(duì)ET-1誘導(dǎo)的收縮呈現(xiàn)出部分抑制作用，抑制率為（44.13±7.04）％（n=6）。當(dāng)去除內(nèi)皮后，BQ788對(duì)ET-1誘導(dǎo)的收縮率明顯加強(qiáng)，達(dá)到（72.59±5.17）％（n=6），與正常氧內(nèi)皮完整組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。這表明內(nèi)皮的存在對(duì)BQ788的抑制作用有明顯影響，去除內(nèi)皮后，肺動(dòng)脈對(duì)BQ788的反應(yīng)性發(fā)生改變，使得其對(duì)ET-1誘導(dǎo)收縮的抑制作用增強(qiáng)。對(duì)于CIH大鼠的肺動(dòng)脈環(huán)，BQ788對(duì)ET-1誘導(dǎo)的收縮抑制作用為（52.79±1.95）％（n=6）。與正常氧內(nèi)皮完整組相比，其抑制作用明顯降低，差異具有極顯著性（P<0.01）。這說明間歇性低氧處理改變了肺動(dòng)脈對(duì)BQ788的反應(yīng)性，導(dǎo)致BQ788對(duì)ET-1誘導(dǎo)收縮的抑制效果減弱。而與去內(nèi)皮組相比，CIH組的抑制作用又明顯高于去內(nèi)皮組，差異具有極顯著性（P<0.01）。這一系列數(shù)據(jù)表明，ET-1誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈收縮作用可受到ETA受體和ETB受體阻斷劑的不同程度影響，且間歇性低氧會(huì)改變肺動(dòng)脈對(duì)ETB受體阻斷劑的敏感性，進(jìn)而影響ET-1與受體結(jié)合介導(dǎo)的血管收縮反應(yīng)。3.4eNOS抑制劑L-NAME對(duì)ET-1誘導(dǎo)血管收縮的影響在正常氧內(nèi)皮完整的情況下，用eNOS抑制劑L-NAME（10??mol/L）預(yù)處理肺動(dòng)脈環(huán)后，ET-1誘導(dǎo)的收縮顯著加強(qiáng)，收縮率達(dá)到（115.68±7.13）％（n=6）。這表明在正常氧條件下，內(nèi)皮細(xì)胞正常合成和釋放的NO對(duì)ET-1誘導(dǎo)的血管收縮具有抑制作用，當(dāng)使用L-NAME抑制eNOS活性，減少NO生成后，ET-1誘導(dǎo)的收縮作用增強(qiáng)。當(dāng)去除內(nèi)皮后，再用L-NAME處理，發(fā)現(xiàn)L-NAME對(duì)ET-1誘導(dǎo)的收縮基本無影響，收縮率為（100.83±6.61）％（n=6），與內(nèi)皮完整組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。這是因?yàn)槿?nèi)皮后，內(nèi)皮細(xì)胞來源的NO不再產(chǎn)生，此時(shí)L-NAME無法進(jìn)一步影響NO的生成，也就不能對(duì)ET-1誘導(dǎo)的收縮產(chǎn)生明顯作用。而在間歇性低氧后，用L-NAME預(yù)處理，結(jié)果顯示L-NAME對(duì)ET-1誘導(dǎo)的收縮產(chǎn)生抑制作用，收縮率為（79.72±8.33）％（n=6）。這與正常氧內(nèi)皮完整情況下L-NAME增強(qiáng)ET-1誘導(dǎo)收縮的結(jié)果相反，說明間歇性低氧改變了血管對(duì)L-NAME的反應(yīng)性以及NO在ET-1誘導(dǎo)血管收縮中的作用機(jī)制。可能是由于間歇性低氧導(dǎo)致內(nèi)皮功能受損，NO生成減少，血管對(duì)ET-1的敏感性增強(qiáng)，此時(shí)L-NAME的作用不再是單純抑制NO生成從而增強(qiáng)ET-1收縮作用，而是通過其他途徑對(duì)ET-1誘導(dǎo)的收縮產(chǎn)生抑制效果，具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。3.5間歇性低氧對(duì)肺動(dòng)脈結(jié)構(gòu)的影響通過對(duì)正常氧組和CIH組大鼠肺動(dòng)脈組織進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察到明顯差異。正常氧組大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮層完整，內(nèi)皮細(xì)胞緊密相連，排列規(guī)則且整齊，細(xì)胞形態(tài)正常，未見明顯的病理改變，平滑肌細(xì)胞排列有序，血管壁結(jié)構(gòu)清晰，各層組織界限分明。而CIH組大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮層出現(xiàn)了顯著的病理學(xué)變化，血管內(nèi)皮細(xì)胞核呈現(xiàn)水腫狀態(tài)，體積增大，染色變淺，局部區(qū)域的內(nèi)皮細(xì)胞從血管壁上脫落，使得內(nèi)皮層出現(xiàn)缺損，平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的增生，導(dǎo)致血管壁增厚，管腔相對(duì)狹窄。這些變化表明間歇性低氧對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮層造成了直接損傷，破壞了內(nèi)皮細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和排列，進(jìn)而影響了血管的正常功能。在透射電鏡下觀察，正常氧組大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞器形態(tài)正常，線粒體呈橢圓形，嵴清晰且排列規(guī)則，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器也未見明顯異常，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞間連接緊密。然而，CIH組大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯病理改變，部分線粒體嵴遭到破壞，變得模糊不清甚至斷裂，線粒體腫脹，內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核糖體脫落，表明細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成等功能受到影響，細(xì)胞膜出現(xiàn)局部破損，細(xì)胞間連接松散，間隙增寬。這些超微結(jié)構(gòu)的改變進(jìn)一步揭示了間歇性低氧對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，影響了細(xì)胞的能量代謝、物質(zhì)合成和細(xì)胞間的信號(hào)傳遞等重要功能，從而導(dǎo)致肺動(dòng)脈內(nèi)皮功能障礙。3.6間歇性低氧對(duì)大鼠肺動(dòng)脈ET-1、ETA受體和ETB受體mRNA及蛋白表達(dá)的影響通過RT-PCR技術(shù)檢測(cè)，與正常氧大鼠相比，CIH大鼠肺動(dòng)脈ET-1和ETA受體mRNA表達(dá)顯著升高，差異具有極顯著性（P<0.01）。其中，ET-1mRNA相對(duì)表達(dá)量在正常氧組為1.00±0.05（n=6），而在CIH組升高至1.85±0.08（n=6）；ETA受體mRNA相對(duì)表達(dá)量在正常氧組為1.00±0.06（n=6），在CIH組升高至1.63±0.07（n=6）。這表明間歇性低氧可促進(jìn)ET-1和ETA受體基因的轉(zhuǎn)錄，使其mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)。然而，ETB受體mRNA表達(dá)卻明顯降低，差異具有極顯著性（P<0.01）。ETB受體mRNA相對(duì)表達(dá)量在正常氧組為1.00±0.05（n=6），在CIH組降至0.45±0.04（n=6），說明間歇性低氧抑制了ETB受體基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致其mRNA表達(dá)水平顯著下降。免疫組織化學(xué)分析其蛋白定位發(fā)現(xiàn)，CIH處理后，大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮層和平滑肌層均有ET-1表達(dá)的增多。在正常氧組大鼠肺動(dòng)脈中，ET-1在內(nèi)皮層和平滑肌層均有一定表達(dá)，但表達(dá)強(qiáng)度較弱；而CIH組大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮層和平滑肌層的ET-1陽(yáng)性染色明顯增強(qiáng)，表明ET-1蛋白表達(dá)量增加。ETA受體主要集中在平滑肌層表達(dá)，并且CIH使血管平滑肌層ETA受體表達(dá)增多。正常氧組大鼠肺動(dòng)脈平滑肌層可見ETA受體表達(dá)，而在CIH組，平滑肌層ETA受體陽(yáng)性染色更為明顯，表達(dá)強(qiáng)度顯著增加。ETB受體在平滑肌層和內(nèi)皮層均有分布，并且CIH后，ETB受體在平滑肌和內(nèi)皮層的表達(dá)均有減少。正常氧組大鼠肺動(dòng)脈平滑肌層和內(nèi)皮層均可檢測(cè)到ETB受體表達(dá)，CIH組中平滑肌層和內(nèi)皮層的ETB受體陽(yáng)性染色均減弱，表達(dá)量明顯降低。這些結(jié)果表明，間歇性低氧不僅影響了ET-1、ETA受體和ETB受體mRNA的表達(dá)，還導(dǎo)致了其蛋白表達(dá)和定位的改變，這些變化可能在間歇性低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈內(nèi)皮功能損傷和對(duì)ET-1敏感性增強(qiáng)中發(fā)揮重要作用。3.7間歇性低氧對(duì)大鼠肺動(dòng)脈組織NO含量及eNOS表達(dá)的影響通過酶轉(zhuǎn)化法測(cè)定肺動(dòng)脈組織中NO的含量，以及運(yùn)用WesternBlotting技術(shù)測(cè)定eNOS蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與正常氧大鼠相比，CIH大鼠肺動(dòng)脈組織NO的含量明顯降低。正常氧組大鼠肺動(dòng)脈組織中NO含量為（56.35±4.21）μmol/L（n=6），而CIH組大鼠肺動(dòng)脈組織中NO含量降至（32.56±3.12）μmol/L（n=6），兩組差異具有極顯著性（P<0.01）。這表明間歇性低氧顯著減少了肺動(dòng)脈組織中NO的生成。同時(shí)，eNOS蛋白表達(dá)也顯著降低。正常氧組大鼠肺動(dòng)脈組織中eNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.06（n=6），CIH組大鼠肺動(dòng)脈組織中eNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量?jī)H為0.48±0.05（n=6），兩組差異具有極顯著性（P<0.01）。eNOS是催化L-精氨酸生成NO的關(guān)鍵酶，其表達(dá)降低進(jìn)一步解釋了NO含量減少的原因，說明間歇性低氧抑制了eNOS的表達(dá)，從而減少了NO的合成，這可能在間歇性低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈內(nèi)皮功能損傷和血管收縮反應(yīng)中起到重要作用。四、分析與討論4.1間歇性低氧導(dǎo)致肺動(dòng)脈內(nèi)皮功能損傷的機(jī)制探討本研究結(jié)果清晰地顯示，間歇性低氧會(huì)對(duì)大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮功能造成顯著損傷。在血管舒張功能方面，CIH組大鼠肺動(dòng)脈對(duì)乙酰膽堿（ACh）的舒張反應(yīng)相較于正常氧內(nèi)皮完整組大幅降低，這表明間歇性低氧嚴(yán)重削弱了肺動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能。從血管結(jié)構(gòu)來看，CIH組大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮層出現(xiàn)明顯病理改變，如內(nèi)皮細(xì)胞核水腫、局部?jī)?nèi)皮細(xì)胞脫落，平滑肌細(xì)胞增生致使血管壁增厚，管腔狹窄。在超微結(jié)構(gòu)層面，CIH組大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體嵴受損、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、細(xì)胞膜破損以及細(xì)胞間連接松散。這些結(jié)果共同表明，間歇性低氧對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮的結(jié)構(gòu)和功能均產(chǎn)生了嚴(yán)重破壞。內(nèi)皮依賴性舒張功能主要依賴于內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放的一氧化氮（NO）。本研究中，CIH大鼠肺動(dòng)脈組織中NO含量明顯降低，同時(shí)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）蛋白表達(dá)也顯著下降。eNOS是催化L-精氨酸生成NO的關(guān)鍵酶，其表達(dá)降低直接導(dǎo)致NO生成減少。NO作為一種重要的血管舒張因子，能夠激活血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的鳥苷酸環(huán)化酶，使環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）生成增加，進(jìn)而引起血管平滑肌舒張。當(dāng)NO含量減少時(shí)，其舒張血管的作用減弱，導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性舒張功能受損。此外，間歇性低氧還可能通過影響eNOS的活性和穩(wěn)定性，進(jìn)一步減少NO的生成。有研究表明，低氧可使eNOS的輔因子四氫生物蝶呤（BH4）生成減少，導(dǎo)致eNOS解偶聯(lián)，不僅無法生成NO，還會(huì)產(chǎn)生大量的超氧陰離子，進(jìn)一步損傷內(nèi)皮功能。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，其分泌功能也會(huì)發(fā)生改變。本研究發(fā)現(xiàn)，CIH大鼠肺動(dòng)脈ET-1和ETA受體mRNA表達(dá)顯著升高，ET-1蛋白在內(nèi)皮層和平滑肌層表達(dá)均增多，ETA受體在平滑肌層表達(dá)增多。ET-1是一種具有強(qiáng)烈縮血管作用的多肽，其與ETA受體結(jié)合后，可通過激活磷脂酶C等信號(hào)通路，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，導(dǎo)致血管平滑肌收縮。ET-1和ETA受體表達(dá)的增加，使得肺動(dòng)脈對(duì)ET-1的敏感性增強(qiáng)，血管收縮作用加劇，進(jìn)一步加重了內(nèi)皮功能損傷。同時(shí)，CIH大鼠肺動(dòng)脈ETB受體mRNA表達(dá)明顯降低，ETB受體在平滑肌層和內(nèi)皮層的蛋白表達(dá)均減少。ETB受體具有雙重作用，一方面可介導(dǎo)ET-1的清除，另一方面可刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO。ETB受體表達(dá)減少，導(dǎo)致其對(duì)ET-1的清除能力下降，同時(shí)NO釋放減少，無法有效對(duì)抗ET-1的縮血管作用，從而促進(jìn)了內(nèi)皮功能損傷和血管收縮。綜上所述，間歇性低氧導(dǎo)致肺動(dòng)脈內(nèi)皮功能損傷的機(jī)制主要包括：NO生成減少，削弱了內(nèi)皮依賴性舒張功能；ET-1及其受體表達(dá)改變，增強(qiáng)了血管對(duì)ET-1的敏感性，加劇了血管收縮；ETB受體表達(dá)降低，影響了ET-1的清除和NO的釋放。這些機(jī)制相互作用，共同導(dǎo)致了肺動(dòng)脈內(nèi)皮功能的損傷，在肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展過程中起到了關(guān)鍵作用。4.2間歇性低氧增強(qiáng)肺動(dòng)脈對(duì)ET-1敏感性的原因分析本研究結(jié)果表明，間歇性低氧可使大鼠肺動(dòng)脈對(duì)ET-1的敏感性顯著增強(qiáng)。其可能原因主要與ET-1及其受體表達(dá)改變密切相關(guān)。從受體表達(dá)層面來看，CIH大鼠肺動(dòng)脈ETA受體mRNA表達(dá)顯著升高，在蛋白水平上，血管平滑肌層ETA受體表達(dá)也明顯增多。ETA受體主要分布于血管平滑肌細(xì)胞，它與ET-1具有高親和力。當(dāng)ETA受體表達(dá)上調(diào)時(shí)，肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上可供ET-1結(jié)合的位點(diǎn)增多，使得ET-1與受體結(jié)合后，更易激活下游信號(hào)通路。研究表明，ET-1與ETA受體結(jié)合后，可通過激活磷脂酶C（PLC），使磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP?）水解生成三磷酸肌醇（IP?）和二酰甘油（DAG）。IP?可促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，從而引起血管平滑肌收縮。DAG則可激活蛋白激酶C（PKC），進(jìn)一步調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的收縮和增殖等活動(dòng)。因此，ETA受體表達(dá)上調(diào)是導(dǎo)致間歇性低氧后肺動(dòng)脈對(duì)ET-1敏感性增強(qiáng)的重要原因之一。與此同時(shí)，CIH大鼠肺動(dòng)脈ETB受體mRNA表達(dá)明顯降低，在蛋白水平上，平滑肌層和內(nèi)皮層的ETB受體表達(dá)均減少。ETB受體在內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞上均有分布，它具有雙重作用。在生理狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞上的ETB受體可介導(dǎo)ET-1的清除，減少ET-1在血管局部的濃度，從而降低其對(duì)血管的收縮作用。此外，ETB受體還可刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO等舒張因子，對(duì)抗ET-1的縮血管效應(yīng)。然而，當(dāng)ETB受體表達(dá)減少時(shí)，其對(duì)ET-1的清除能力下降，導(dǎo)致ET-1在血管局部積聚，濃度升高。同時(shí)，由于ETB受體減少，內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO的能力也降低，無法有效對(duì)抗ET-1的縮血管作用，使得肺動(dòng)脈對(duì)ET-1的敏感性增強(qiáng)。綜上所述，間歇性低氧導(dǎo)致肺動(dòng)脈對(duì)ET-1敏感性增強(qiáng)，主要是由于ETA受體表達(dá)上調(diào)，增加了ET-1與受體的結(jié)合位點(diǎn)，增強(qiáng)了其收縮血管的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；以及ETB受體表達(dá)減少，削弱了對(duì)ET-1的清除和舒張血管因子的釋放，無法有效拮抗ET-1的縮血管作用。這兩種受體表達(dá)的改變共同作用，使得肺動(dòng)脈對(duì)ET-1的敏感性顯著增強(qiáng)，在間歇性低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。4.3ET-1、ETA受體和ETB受體在間歇性低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈變化中的作用ET-1作為一種具有強(qiáng)大生物活性的多肽，在間歇性低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈變化中扮演著核心角色。在正常生理狀態(tài)下，肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)持續(xù)分泌少量的ET-1，它與血管平滑肌細(xì)胞上的ETA受體和ETB受體相互作用，共同維持著血管的正常張力和結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)。然而，當(dāng)機(jī)體處于間歇性低氧環(huán)境時(shí)，這種平衡被打破。本研究發(fā)現(xiàn)，間歇性低氧會(huì)導(dǎo)致大鼠肺動(dòng)脈ET-1和ETA受體mRNA表達(dá)顯著升高，ET-1蛋白在內(nèi)皮層和平滑肌層表達(dá)均增多，ETA受體在平滑肌層表達(dá)增多。ET-1與ETA受體具有高度親和力，兩者結(jié)合后，可激活一系列復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。如通過激活磷脂酶C（PLC），使磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP?）水解生成三磷酸肌醇（IP?）和二酰甘油（DAG）。IP?能夠促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度迅速升高，從而引發(fā)血管平滑肌強(qiáng)烈收縮。DAG則可激活蛋白激酶C（PKC），進(jìn)一步調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的收縮和增殖等活動(dòng)，導(dǎo)致血管壁增厚，管腔狹窄，促進(jìn)肺動(dòng)脈高壓的發(fā)展。ETB受體在間歇性低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈變化中也具有不可忽視的作用。正常情況下，ETB受體在內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞上均有分布，且在維持血管穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著雙重調(diào)節(jié)作用。一方面，內(nèi)皮細(xì)胞上的ETB受體可介導(dǎo)ET-1的清除，減少ET-1在血管局部的濃度，從而降低其對(duì)血管的收縮作用。另一方面，ETB受體還能刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO等舒張因子，對(duì)抗ET-1的縮血管效應(yīng)。然而，本研究表明，間歇性低氧會(huì)使ETB受體mRNA表達(dá)明顯降低，在蛋白水平上，平滑肌層和內(nèi)皮層的ETB受體表達(dá)均減少。這導(dǎo)致ETB受體對(duì)ET-1的清除能力顯著下降，使得ET-1在血管局部積聚，濃度升高。同時(shí)，由于ETB受體減少，內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO的能力也降低，無法有效對(duì)抗ET-1的縮血管作用，進(jìn)一步加劇了血管收縮和肺動(dòng)脈高壓的發(fā)展。綜上所述，在間歇性低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈變化中，ET-1、ETA受體和ETB受體之間存在著復(fù)雜的相互作用。ET-1通過與ETA受體結(jié)合，激活收縮相關(guān)信號(hào)通路，導(dǎo)致血管收縮和重構(gòu)；而ETB受體的表達(dá)改變則削弱了其對(duì)ET-1的清除和舒張血管因子的釋放，無法有效拮抗ET-1的縮血管作用。這種ET-1及其受體表達(dá)和功能的失衡，在肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展過程中起到了關(guān)鍵作用，為深入理解間歇性低氧誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓的機(jī)制提供了重要線索，也為開發(fā)針對(duì)該疾病的治療策略提供了潛在的靶點(diǎn)。4.4研究結(jié)果與現(xiàn)有理論的對(duì)比和聯(lián)系本研究結(jié)果與現(xiàn)有理論在多個(gè)方面存在緊密聯(lián)系，同時(shí)也展現(xiàn)出一定的差異。在間歇性低氧與肺動(dòng)脈內(nèi)皮功能損傷的關(guān)系上，現(xiàn)有理論認(rèn)為，內(nèi)皮功能受損會(huì)導(dǎo)致血管舒張功能障礙，而一氧化氮（NO）作為內(nèi)皮細(xì)胞釋放的重要舒張因子，其生成減少是內(nèi)皮功能損傷的關(guān)鍵機(jī)制之一。本研究結(jié)果與之高度相符，CIH大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能顯著降低，同時(shí)肺動(dòng)脈組織中NO含量明顯減少，內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）蛋白表達(dá)也顯著下降。這表明間歇性低氧通過抑制eNOS表達(dá)，減少NO生成，從而損傷了肺動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能，進(jìn)一步證實(shí)了現(xiàn)有理論中NO在維持內(nèi)皮功能中的重要作用。在間歇性低氧對(duì)ET-1敏感性的影響方面，現(xiàn)有研究指出，ET-1與受體結(jié)合后可引發(fā)血管收縮，且在病理狀態(tài)下，ET-1及其受體表達(dá)改變會(huì)導(dǎo)致血管對(duì)ET-1的敏感性增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，CIH大鼠肺動(dòng)脈ETA受體mRNA表達(dá)顯著升高，蛋白水平上血管平滑肌層ETA受體表達(dá)也明顯增多，同時(shí)ETB受體mRNA表達(dá)明顯降低，蛋白水平上平滑肌層和內(nèi)皮層的ETB受體表達(dá)均減少。這使得肺動(dòng)脈對(duì)ET-1的敏感性增強(qiáng)，與現(xiàn)有理論中ET-1及其受體表達(dá)改變影響血管對(duì)ET-1敏感性的觀點(diǎn)一致。然而，本研究也有新的發(fā)現(xiàn)。在eNOS抑制劑L-NAME對(duì)ET-1誘導(dǎo)血管收縮的影響上，現(xiàn)有理論認(rèn)為在正常氧條件下，抑制eNOS活性會(huì)增強(qiáng)ET-1誘導(dǎo)的血管收縮。但本研究發(fā)現(xiàn)，間歇性低氧后，L-NAME對(duì)ET-1誘導(dǎo)的收縮產(chǎn)生抑制作用，這與正常氧條件下的結(jié)果相反。這表明間歇性低氧改變了血管對(duì)L-NAME的反應(yīng)性以及NO在ET-1誘導(dǎo)血管收縮中的作用機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究間歇性低氧誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓的機(jī)制提供了新的線索。本研究結(jié)果與現(xiàn)有理論相互印證，進(jìn)一步豐富和完善了間歇性低氧對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮功能及ET-1敏感性影響的理論體系，同時(shí)新的發(fā)現(xiàn)也為該領(lǐng)域的后續(xù)研究指明了方向。4.5研究的創(chuàng)新點(diǎn)與局限性本研究具有多方面的創(chuàng)新之處。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上，采用模擬阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征的間歇性低氧模式，對(duì)大鼠進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的間歇性低氧處理，這種模式更貼近臨床實(shí)際情況，能夠更真實(shí)地反映間歇性低氧對(duì)肺動(dòng)脈的影響。與以往一些研究中采用的單純低氧或短時(shí)間低氧處理相比，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更具臨床相關(guān)性，為深入研究間歇性低氧誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓的機(jī)制提供了更可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。在指標(biāo)檢測(cè)方面，本研究綜合運(yùn)用多種先進(jìn)技術(shù)，從多個(gè)層面檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。不僅檢測(cè)了肺動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能、對(duì)ET-1的敏感性等功能學(xué)指標(biāo)，還深入探究了ET-1及其受體在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化，以及肺動(dòng)脈組織中NO含量及eNOS表達(dá)等分子生物學(xué)指標(biāo)。通過這種多維度的檢測(cè)，全面揭示了間歇性低氧對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮功能的損傷機(jī)制，為該領(lǐng)域的研究提供了更豐富、更全面的數(shù)據(jù)支持。然而，本研究也存在一定的局限性。在樣本量方面，雖然每組設(shè)置了15只大鼠，但對(duì)于一些復(fù)雜的機(jī)制研究來說，樣本量可能相對(duì)較小。較小的樣本量可能會(huì)影響研究結(jié)果的普遍性和可靠性，增加結(jié)果的偶然性。未來的研究可以進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，以提高研究結(jié)果的可信度。本研究?jī)H在大鼠模型上進(jìn)行，動(dòng)物模型與人類的生理病理情況存在一定差異。盡管大鼠模型在心血管疾病研究中具有廣泛應(yīng)用，但不能完全等同于人類。因此，本研究結(jié)果向臨床轉(zhuǎn)化時(shí)可能存在一定的局限性。后續(xù)研究需要結(jié)合臨床樣本和病例，進(jìn)一步驗(yàn)證本研究的結(jié)論，以更好地指導(dǎo)臨床實(shí)踐。本研究主要關(guān)注了間歇性低氧對(duì)肺動(dòng)脈的影響，而未考慮其他可能的影響因素，如遺傳因素、其他合并癥等。在實(shí)際臨床中，患者往往存在多種因素相互作用。未來研究可以進(jìn)一步拓展研究范圍，綜合考慮多種因素，以更全面地揭示肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制。五、結(jié)論與展望5.1研究主要結(jié)論總結(jié)本研究通過構(gòu)建間歇性低氧（CIH）大鼠模型，深入探究了間歇性低氧對(duì)大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮素-1（ET-1）敏感性及內(nèi)皮損傷的影響，取得了一系列重要研究成果。在肺動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能方面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CIH組大鼠肺動(dòng)脈對(duì)乙酰膽堿（ACh）的舒張反應(yīng)顯著低于正常氧內(nèi)皮完整組，差異具有極顯著性（P<0.01），但明顯高于正常氧去內(nèi)皮組（P<0.01）。這清晰地揭示了間歇性低氧會(huì)嚴(yán)重削弱大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能，導(dǎo)致內(nèi)皮功能受損。關(guān)于ET-1對(duì)肺動(dòng)脈收縮作用及相關(guān)影響，研究發(fā)現(xiàn)大鼠肺動(dòng)脈對(duì)ET-1誘導(dǎo)的收縮呈典型的劑量依賴性增強(qiáng)。與正常氧內(nèi)皮完整肺動(dòng)脈環(huán)相比，去除內(nèi)皮和CIH均能使肺動(dòng)脈對(duì)ET-1的敏感性顯著增強(qiáng)（P<0.01），且去內(nèi)皮組肺動(dòng)脈環(huán)對(duì)ET-1誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)比CIH組更敏感（P<0.01）。這充分說明間歇性低氧能夠提高大鼠肺動(dòng)脈對(duì)ET-1的敏感性。在ET受體阻斷劑對(duì)ET-1誘導(dǎo)肺動(dòng)脈環(huán)收縮作用的影響上，對(duì)于不同組的大鼠肺動(dòng)脈環(huán)，BQ123（ETA受體阻斷劑）幾乎均能完全阻斷ET-1誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈收縮。正常氧內(nèi)皮完整的大鼠肺動(dòng)脈，BQ788（ETB受體阻斷劑）部分抑制ET-1誘導(dǎo)的收縮。去除內(nèi)皮后，BQ788對(duì)ET-1誘導(dǎo)的收縮率明顯加強(qiáng)。對(duì)于CIH大鼠的肺動(dòng)脈環(huán)，BQ788對(duì)ET-1誘導(dǎo)的收縮抑制作用明顯低于正常氧內(nèi)皮完整組（P<0.01），但明顯高于去內(nèi)皮組（P<0.01）。這表明ET-1誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈收縮作用受到ETA受體和ETB受體阻斷劑的不同程度影響，且間歇性低氧會(huì)改變肺動(dòng)脈對(duì)ETB受體阻斷劑的敏感性。在eNOS抑制劑L-NAME對(duì)ET-1誘導(dǎo)血管收縮的影響方面，在正常氧內(nèi)皮完整的情況下，L-NAME可顯著加強(qiáng)ET-1誘導(dǎo)的收縮。去除內(nèi)皮后，L-NAME對(duì)ET-1誘導(dǎo)的收縮基本無影響。而間歇性低氧后，L-NAME對(duì)ET-1誘導(dǎo)的收縮產(chǎn)生抑制作用。這說明間歇性低氧改變了血管對(duì)L-NAME的反應(yīng)性以及NO在ET-1誘導(dǎo)血管收縮中的作用機(jī)制。從組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果來看，HE染色顯示正常氧大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)