2026《金版教程》高考復習方案生物經典不定項版-第十單元 小單元3 第1課時 基因工程的基本工具和基本操作程序

選擇性必修3

生物技術與工程第十單元

生物技術與工程小單元3基因工程第1課時基因工程的基本工具和基本操作程序

1.概述基因工程是在遺傳學、微生物學、生物化學和分子生物學等學科基礎上發展而來的。2.闡明DNA重組技術的實現需要利用限制性內切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。3.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的獲取、基因表達載體的構建、目的基因導入受體細胞和目的基因及其表達產物的檢測鑒定等步驟。4.DNA的粗提取與鑒定。5.DNA片段的擴增及電泳鑒定。目錄CONTENTS02經典考題訓練01知識自主梳理03課時作業01知識自主梳理一基因工程的概念及基本工具1．基因工程概念(1)手段：按照____________，通過________等技術，賦予生物新的遺傳特性。(2)目的：創造出更符合人們需要的新的___________和__________。(3)水平：______水平。由于在DNA分子水平上進行設計和施工，因此又叫作_____________技術。人們的愿望轉基因生物類型生物產品分子重組DNA知識拓展基因工程的理論基礎2．重組DNA技術的基本工具(1)限制性內切核酸酶(簡稱：_________)限制酶核苷酸序列磷酸二酯鍵黏性末端常用類型E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源___________T4噬菌體功能“縫合”___________________。E.coliDNA連接酶連接平末端的效率遠遠低于T4DNA連接酶結果恢復被限制酶切開的____________(2)DNA連接酶①作用：將限制酶切割下來的DNA片段_____________________。②類型拼接成新的DNA分子大腸桿菌黏性末端和平末端磷酸二酯鍵(3)載體①種類：質粒(常用載體，是環狀雙鏈DNA分子)、________、動植物病毒等。②質粒

③作用：攜帶外源DNA片段進入受體細胞。噬菌體有一個至多個自我復制受體DNA標記重組DNA分子的篩選二基因工程的基本操作程序1．目的基因的篩選與獲取(1)目的基因：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞______或獲得預期__________等的基因。(2)篩選合適的目的基因從相關的已知________________的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。利用序列數據庫和序列比對工具進行篩選。(3)目的基因的獲取①人工合成目的基因。②常用______(聚合酶鏈式反應)特異性地快速擴增目的基因性狀表達產物結構和功能清晰PCRPCR定義在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術PCR原理DNA____________條件模板___________________原料4種脫氧核苷酸酶耐高溫的____________引物一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈______。2種在一定的緩沖溶液中進行；需要控制溫度的變化半保留復制目的基因的兩條鏈DNA聚合酶核酸PCR反應過程變性當溫度__________時，雙鏈DNA解聚為單鏈復性溫度下降到______左右時，兩種引物通過_____________與兩條單鏈DNA結合延伸72℃左右時，在___________________作用下，從引物3′端開始進行互補鏈的合成超過90℃50℃堿基互補配對耐高溫的DNA聚合酶擴增方向DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從引物的3′端延伸DNA鏈，即DNA的合成方向總是從子鏈的___________延伸方式指數形式擴增(約為2n，n為擴增循環的次數)結果___________________________產物鑒定瓊脂糖凝膠電泳5′端向3′端短時間內大量擴增目的基因知識拓展1．在PCR過程中實際加入的為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。2．引物既可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈。細胞內的DNA進行復制時，也需要引物，一般為RNA片段。3．真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應緩沖溶液中一般要添加Mg2＋。③還可以通過構建基因文庫來獲取目的基因。2．基因表達載體的構建——基因工程的核心工作(1)操作目的使目的基因在受體細胞中__________，并且______給下一代，同時，使目的基因能夠______和發揮作用。(2)基因表達載體組成穩定存在遺傳表達啟動子上游RNA聚合酶轉錄終止子下游RNA聚合酶轉錄標記基因目的基因(3)構建過程標記基因限制酶DNA連接細胞類型方法原理/操作步驟植物細胞花粉管通道法①可以用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入_____中；②可以在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在___________，使目的基因借助____________進入胚囊3．將目的基因導入受體細胞子房花柱切面上花粉管通道植物細胞農桿菌轉化法農桿菌細胞內含有Ti質粒，當它侵染植物細胞后，能將Ti質粒上的_________(可轉移的DNA)轉移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的_____________上。如果將目的基因插入Ti質粒的T-DNA中，通過農桿菌的轉化作用，就可以使目的基因進入植物細胞T-DNA染色體DNA動物細胞(受精卵)_________技術將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發育→獲得具有新性狀的動物微生物細胞(原核細胞)Ca2＋處理法用______處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，然后再將重組的基因表達載體導入其中顯微注射Ca2＋4.目的基因的檢測與鑒定三實驗1．DNA的粗提取與鑒定(1)基本原理①提取原理：DNA、RNA、蛋白質和脂質等在________________方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當的物理或化學方法對它們進行提取。例如，DNA不溶于______，但某些蛋白質溶于______；DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol·L－1的___________。②鑒定原理：在一定溫度下，DNA遇________試劑會呈現藍色。物理和化學性質酒精NaCl溶液酒精二苯胺(2)實驗步驟(以洋蔥為例)研磨液上清液95%一個方向2mol/L二苯胺5min藍色特別提醒

1．加入酒精后用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成絲狀沉淀。2．本實驗不能用哺乳動物成熟的紅細胞作為實驗材料，原因是哺乳動物成熟的紅細胞無細胞核(無DNA)。可選用雞血細胞作為材料。2．DNA片段的擴增及電泳鑒定(1)PCR儀PCR儀實質上就是一臺能夠自動調控溫度的儀器。一次PCR一般要經歷30次循環。(2)電泳鑒定PCR產物的原理①PCR原理：利用了DNA的熱變性原理。②電泳DNA分子具有可解離的基團，在一定的______下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相___的電極移動，這個過程就是電泳。③鑒定原理PCR的產物一般通過____________電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與__________________________________等有關。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長300nm的紫外燈下被檢測出來。pH瓊脂糖凝膠凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象反(3)實驗步驟①PCR實驗操作步驟②DNA的電泳鑒定紫外燈(4)注意事項①為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行__________處理。②該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在______℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。③在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。④在進行操作時，一定要戴好一次性手套。高壓滅菌－201．DNA連接酶可以連接目的基因與載體的氫鍵，形成重組DNA。()2．質粒通常采用抗生素合成基因作為標記基因。()3．目的基因一定是編碼蛋白質的基因。()4．基因表達載體中的啟動子和終止子決定著翻譯的開始與結束。()5．Ti質粒上的T-DNA可與植物受體細胞的染色體DNA整合在一起。()6．為培育抗除草劑的作物新品種，導入抗除草劑基因時只能以受精卵為受體。()×√××××7．檢測目的基因是否導入受體細胞可用抗原—抗體雜交技術。()8．基因工程中所用的質粒大都是天然質粒，在受體細胞中自我復制。()9．限制酶只能用于切割目的基因。()10．若受體大腸桿菌含有構建重組質粒時用到的限制性內切核酸酶，則一定有利于該重組質粒進入受體并保持結構穩定。()11．載體質粒的標記基因可以有一個或多個。()×√×××12．用PCR方法擴增目的基因時需要設計兩種引物。()13．PCR中加熱到50℃左右的目的是在TaqDNA聚合酶作用下合成子鏈。()14．農桿菌轉化法是將目的基因導入雙子葉植物常采用的方法。()15．通過接種病原體對轉基因的植株進行抗病性鑒定。()16．只有用相同的限制酶處理含目的基因的DNA片段和質粒，才能形成重組質粒。()×√√√×17．構建重組質粒時，使用兩種限制酶可避免質粒和目的基因的環化，還能避免目的基因與質粒反向連接。()18．將基因表達載體導入小鼠的受精卵中常用顯微注射法。()19．只要目的基因進入受體細胞就能實現表達。()20．限制酶能夠識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的氫鍵斷開。()21．DNA連接酶是將單個脫氧核苷酸連接在已有DNA片段上的酶。()×√√××22．引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。()23．啟動子是一段有特殊序列結構的DNA片段，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動DNA的復制過程。()24．構建基因表達載體是基因工程的核心工作。()25．轉化是指目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。()×√√√26．“DNA的粗提取與鑒定”實驗中，過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進行是為了防止DNA降解。()27．在“DNA的粗提取與鑒定”實驗中，離心研磨液是為了加速DNA的沉淀。()28．用二苯胺試劑鑒定DNA時，溶液藍色深淺反映DNA含量的多少。()29．粗提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺試劑后顯藍色。()×√√×30．凝膠中的DNA分子通過染色，可在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。()31．電泳時，應有一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物。()32．以新鮮洋蔥為材料進行DNA粗提取實驗，若研磨、過濾不充分，則會直接影響提取的DNA量。()33．DNA粗提取所依據的原理是加入體積分數為70%的冷酒精，DNA會從溶液中析出。()×√√√經典考題訓練02考向一結合基因工程所需工具酶和載體，考查科學思維能力[例1]

(2023·新課標，6)某同學擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應限制酶的識別序列和切割位點)和質粒進行切割、連接，以構建重組表達載體。限制酶的切割位點如圖所示。下列重組表達載體構建方案合理且效率最高的是(

)A．質粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B．質粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C．質粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D．質粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接解析：用酶3切割質粒和目的基因產生的是平末端，而E.coliDNA連接酶連接平末端的效率低，A錯誤；用酶1切割目的基因，產生的是黏性末端，用酶3切割質粒，產生的是平末端，無法連接，B錯誤；質粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4DNA連接酶連接，使目的基因定向插到質粒中，C正確；酶2和酶4切割后產生的黏性末端相同，易導致目的基因和質粒自身環化或者使目的基因在質粒中反向連接，并且用酶4切割會破壞標記基因，D錯誤。[例2]

(不定項)第三代疫苗——DNA疫苗是指將編碼保護性抗原蛋白的基因(如圖甲)插入到適宜的質粒(如圖乙)中得到的重組DNA分子，將其導入人體內，在人體細胞內表達的產物可直接誘導機體免疫應答，且可持續一段時間。限制性內切核酸酶的切點分別如圖所示。下列分析錯誤的是(

)A．構建DNA疫苗時，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和質粒B．圖乙中只用EcoRⅠ切割后的質粒，含有2個游離的磷酸基團C．用EcoRⅠ切割目的基因和質粒，再用DNA連接酶連接，只產生1種連接產物D．抗原基因在體內表達時需要解旋酶解析：用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和質粒，產生的片段可連接成重組DNA分子，A正確；質粒為環狀DNA，其上含有一個EcoRⅠ的切點，因此用EcoRⅠ切割后，該環狀DNA分子變為鏈狀DNA分子，因每條核苷酸鏈上含有1個游離的磷酸基團，故切割后的質粒DNA含有2個游離的磷酸基團，B正確；用EcoRⅠ切割目的基因和質粒，再用DNA連接酶連接后能有多種連接產物，如目的基因自身環化、質粒自身環化、目的基因與質粒正向或反向連接等，C錯誤；基因表達包括轉錄和翻譯，轉錄時不需要解旋酶，在RNA聚合酶的作用下，DNA即可解旋，D錯誤。1．與DNA有關的幾種酶的比較2．限制酶的選擇技巧(1)根據目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類①應選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。②不能選擇切點位于目的基因內部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。③為避免目的基因和質粒的自身環化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質粒上也有這兩種酶的切點)。(2)根據質粒的特點確定限制酶的種類考向二結合PCR技術的操作和應用，考查科學思維能力[例3]

(2022·遼寧，12)抗蟲和耐除草劑玉米雙抗12－5是我國自主研發的轉基因品種。為給監管轉基因生物安全提供依據，采用PCR方法進行目的基因監測，反應程序如圖所示。下列敘述正確的是(

)A．預變性過程可促進模板DNA邊解旋邊復制B．后延伸過程可使目的基因的擴增更加充分C．延伸過程無需引物參與即可完成半保留復制D．轉基因品種經檢測含有目的基因后即可上市解析：預變性的溫度為94℃，在這個溫度下，雙鏈DNA解旋為單鏈，但模板鏈不易和引物結合，不能進行復制，A錯誤；延伸的目的是合成新的子鏈，后延伸延長了延伸時間，使目的基因的擴增更加充分，B正確；延伸過程需要引物與模板鏈結合，使耐高溫的DNA聚合酶在引物的3′端加上相應的脫氧核苷酸，C錯誤；轉基因品種經檢測含有目的基因且已經表達使生物體表現出相應性狀后，還需要經過系列的安全性評價，符合相應標準后才能上市，D錯誤。[例4]

PCR反應中使用的引物的3′端為結合模板DNA的關鍵堿基，而5′端則無嚴格限制，常用于給目的基因兩側添加限制酶切點等序列。下列相關敘述正確的是(

)A．PCR第3個循環，消耗了7對引物B．反應體系中游離的脫氧核苷酸作為PCR擴增的原料會依次連接到引物的5′端C．耐高溫的DNA聚合酶能將單個脫氧核苷酸結合到雙鏈DNA片段的引物鏈上D．用圖中引物擴增僅需2個循環后就能獲得兩端均添加限制酶切點的目的基因解析：該DNA是雙鏈，第一次循環需要1對引物，第二次需要2對，第三次需要4對，第四次需要8對，即PCR第3個循環，消耗了4對引物，A錯誤；進行PCR時，擴增是從引物的3′端延伸，因此脫氧核苷酸作為擴增的原料會依次連接到3′端，B錯誤；耐高溫的DNA聚合酶能將單個脫氧核苷酸連續結合到雙鏈DNA片段的引物鏈上，C正確；由圖示可知，第一、二輪循環合成的子鏈長度均不同，根據半保留復制特點可知，前兩輪循環產生的四個DNA分子的兩條鏈均不等長，第三輪循環產生的DNA分子存在等長的兩條核苷酸鏈，即用圖中引物擴增至少3個循環后才能獲得兩端均添加限制酶切點的目的基因，D錯誤。考向三圍繞DNA片段的擴增及電泳鑒定，考查科學探究能力[例5]

(2024·黑吉遼，7)關于采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物的實驗，下列敘述正確的是(

)A．瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小B．凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指示DNA分子的具體位置C．在同一電場作用下，DNA片段越長，向負極遷移速率越快D．瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在紫光燈下被檢測出來解析：瓊脂糖凝膠的濃度會影響DNA分子在凝膠中的遷移率和分辨率，瓊脂糖凝膠的濃度通常是根據所需分離的DNA片段大小來選擇的，對于較大的DNA片段，比如基因組DNA或質粒DNA，通常選擇較低濃度的瓊脂糖凝膠，因為它們需要更大的孔徑來有效遷移，而對于較小的DNA片段，比如PCR產物或酶切片段，則需要選擇較高濃度的瓊脂糖凝膠，以提供更好的分辨率和分離效果，A正確；凝膠載樣緩沖液中指示劑只是指示電泳進度，當指示劑前沿接近凝膠邊緣時，則停止電泳，它不能指示DNA分子的具體位置，B錯誤；在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關，在同一電場作用下，DNA片段(帶負電)越長，DNA向正極遷移的速率越慢，C錯誤；瓊脂糖凝膠中的DNA分子與其中的核酸染料結合后，可在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來，D錯誤。解析：根據題意可知，2對等位基因的遺傳遵循自由組合定律。設電泳圖中從上部到下部分別是基因a1、a2、b1、b2的PCR產物的電泳結果，則P1、P2的基因型分別為a1a1b2b2、a2a2b1b1，F1的基因型為a1a2b1b2，①～⑧的基因型分別為a1a2b1b1、a1a2b2b2、a1a1b1b2、a2a2b1b1、a1a1b1b1、a1a1b2b2、a2a2b2b2、a1a2b1b2。由試題分析可知，①②個體的基因型分別為a1a2b1b1、a1a2b2b2，均為雜合體，F1的基因型為a1a2b1b2，F1自交所得F2中③(a1a1b1b2)所占的比例為1/4×1/2＝1/8，⑤(a1a1b1b1)所占的比例為1/4×1/4＝1/16，A正確；F2個體的基因型有9種，電泳圖中未顯示的F2個體的基因型為a2a2b1b2，其相關基因的PCR產物電泳結果有3條帶，B正確；③(a1a1b1b2)和⑦(a2a2b2b2)雜交，子代的基因型有2種，分別為a1a2b2b2、a1a2b1b2，③和⑦雜交子代相關基因的PCR產物電泳結果與②(a1a2b2b2)和⑧(a1a2b1b2)電泳結果相同，C正確；①(a1a2b1b1)自交，子代的基因型為1/4a1a1b1b1、1/2a1a2b1b1、1/4a2a2b1b1，①自交子代相關基因的PCR產物電泳結果與④(a2a2b1b1)電泳結果相同的占1/4，D錯誤。

[例7]

(2023·山東，25)科研人員構建了可表達J－V5融合蛋白的重組質粒并進行了檢測，該質粒的部分結構如圖甲所示。其中V5編碼序列表達標簽短肽V5。(1)與圖甲中啟動子結合的酶是____________。除圖甲中標出的結構外，作為載體，質粒還需具備的結構有________________________________(答出2個結構即可)。考向四圍繞基因工程的基本操作程序，考查科學思維能力RNA聚合酶標記基因、復制原點(或限制性酶切位點)(2)構建重組質粒后，為了確定J基因連接到質粒中且插入方向正確，需進行PCR檢測，若僅用一對引物，應選擇圖甲中的引物_________________。已知J基因轉錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的______(填“a鏈”或“b鏈”)相應部分的序列相同。F2和R1(或F1a鏈和R2)(3)重組質粒在受體細胞內正確表達后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測相應蛋白是否表達以及表達水平，結果如圖乙所示。其中，出現條帶1證明細胞內表達了______________，條帶2所檢出的蛋白______(填“是”或“不是”)由重組質粒上的J基因表達的。J－V5融合蛋白不是解析：(1)啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因的轉錄。質粒作為載體，需要有復制原點、一個至多個限制酶切割位點和便于重組質粒篩選的標記基因等。(2)用PCR擴增分析法確定重組質粒中目的基因插入方向是否正確時，常設計一對引物，一個引物與目的基因序列互補，另一個引物與質粒序列互補，兩引物延伸方向相反，以擴增出兩引物間的序列，若插入方向正確，則可擴增出相應序列，反之，則不能擴增出相應序列，故選用的引物應為F2、R1或F1、R2，若選用引物F1、R1，不論目的基因插入方向是否正確，都可擴增出目的基因序列。因為J基因的b鏈為轉錄的模板鏈，啟動子在左側，所以轉錄方向為從左到右，由于轉錄沿模板鏈3′到5′端方向合成RNA，所以J基因b鏈左側為3′端，引物要與DNA的3′端互補配對，所以F1與b鏈互補，a鏈也與b鏈互補，由此推知引物F1與a鏈相應部分序列相同。(3)抗J蛋白抗體和抗V5抗體均能檢測到條帶1，說明條帶1為J－V5融合蛋白，條帶2僅能由抗J蛋白抗體檢測到，說明該蛋白僅含J蛋白，不含V5標簽，故條帶2檢出的蛋白不是由重組質粒上的J基因表達的。A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉錄的產物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環素)培養基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術鑒定重組質粒構建成功與否D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養基中能形成菌落[例8]

(不定項)(2023·湖北，4，改編)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環素抗性基因(TetR)作為標記基因構建的質粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質粒，構建基因表達載體(重組質粒)，并轉化到受體菌中。下列敘述正確的是(

)解析：若用HindⅢ酶切質粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA連接酶將兩者連接成重組質粒，目的基因和質粒有正向連接和反向連接兩種連接形式，因此，目的基因轉錄的產物可能不同，A正確；若用PvuⅠ酶切，會破壞氨芐青霉素抗性基因，在含Tet(四環素)培養基中的菌落可能是含有目的基因的重組質粒，也可能是質粒自身連接的普通質粒，因此，在含Tet(四環素)培養基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確；若用SphⅠ酶切，由于重組質粒和普通質粒的堿基對數不同，因此可通過DNA凝膠電泳技術鑒定重組質粒構建成功與否，C正確；若用SphⅠ酶切，會破壞四環素抗性基因，氨芐青霉素抗性基因不受影響，因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)的培養基中能形成菌落，不能在含Tet(四環素)的培養基中形成菌落，D錯誤。[例9]鋅轉運蛋白在某種植物根部細胞特異性表達并定位于細胞質膜，具有吸收和轉運環境中Zn2＋的功能。為研究該植物某種鋅轉運蛋白與吸收Zn2＋相關的生物學功能，通過基因工程對鋅吸收缺陷型酵母進行轉化。回答下列問題：(1)擴增鋅轉運蛋白基因時，以該植物__________為材料提取并純化mRNA，通過________合成cDNA。設計引物進行PCR擴增，PCR完成以后產物通常采用________________來鑒定。根部細胞逆轉錄瓊脂糖凝膠電泳(2)為便于鋅轉運蛋白基因與質粒連接，需在PCR引物的____端加上限制酶識別序列，且兩種引物含不同的限制酶識別序列，主要目的是為了防止構建基因表達載體時出現______________________________________________________(答出一點即可)。為保證鋅轉運蛋白基因的表達，常利用酵母質粒作為載體，并借助質粒上原有基因的________________，需將目的基因插入在它們之間。(3)酵母菌轉化，取凍存的鋅吸收缺陷型酵母菌株，活化、培養后用重組表達載體轉化酵母菌。轉化前一般用醋酸鋰處理酵母菌細胞，使細胞處于感受態，目的是_________________________，通過__________________檢測目的基因在受體細胞中表達鋅轉運蛋白水平的高低。5′目的基因自身環化；質粒的自身環化；目的基因的反向連接啟動子與終止子使細胞易于吸收外源DNA抗原—抗體雜交法(4)已知鋅吸收缺陷型酵母增殖較慢，通過設置一個固體培養基來鑒定轉化酵母是否賦予了鋅吸收特性。配置含適量Zn2＋的(酵母菌)固體培養基、滅菌，分成a、b兩半區域，a區接種涂布少量的缺陷型酵母，b區接種涂布少量的轉化酵母，在適宜的條件下培養一段時間后，如何判斷有轉化成功的酵母？________________________________。b區有些菌落明顯大于a區的菌落解析：(1)鋅轉運蛋白在某種植物根部細胞特異性表達并定位于細胞質膜，所以以該植物的根為材料提取并純化mRNA，逆轉錄合成cDNA。PCR完成以后產物通常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。(2)PCR過程中，由于DNA子鏈是從引物的3′端延伸，因此在設計引物時，只能在兩條引物的5′端加上限制酶識別序列。兩種引物含不同的限制酶識別序列，主要目的是為了防止構建基因表達載體時出現目的基因自身環化、質粒的自身環化或目的基因的反向連接。要將鋅轉運蛋白基因插入到質粒的啟動子和終止子之間，才能保證鋅轉運蛋白基因的表達。(3)轉化前一般用醋酸鋰處理酵母菌細胞，使細胞處于感受態，目的是改變細胞膜的通透性，使細胞易于吸收外源DNA。可采用抗原—抗體雜交法檢測目的基因在受體細胞中表達鋅轉運蛋白的水平。(4)配置含適量Zn2＋的(酵母菌)固體培養基、滅菌，分成a、b兩半區域，a區接種涂布少量的缺陷型酵母，b區接種涂布少量的轉化酵母，由于鋅吸收缺陷型酵母增殖較慢，轉化成功的酵母賦予了鋅吸收特性后增殖較快，在適宜的條件下培養一段時間后，b區有些菌落明顯大于a區的菌落，說明有轉化成功的酵母。如何篩選出含有目的基因的受體細胞(1)原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果插入某種抗生素抗性基因內部，則會導致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入了四環素抗性基因內部，則四環素抗性基因失活。(2)被轉化的細菌有三種：含環狀目的基因的細菌、含重組質粒的細菌、含質粒的細菌。(3)篩選方法：將轉化后的細菌先放在含氨芐青霉素的培養基上培養，能生長的是含重組質粒的細菌和含質粒的細菌，如圖1、2、3、4、5菌落，再利用滅菌的絨布影印到含有四環素的培養基上，如圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環素培養基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養基上挑取1、5菌落進行培養。考向五圍繞DNA的粗提取與鑒定，考查實驗探究能力[例10]

(2024·山東，13)關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法正確的是(

)A．整個提取過程中可以不使用離心機B．研磨液在4℃冰箱中放置幾分鐘后，應充分搖勻再倒入燒杯中C．鑒定過程中DNA雙螺旋結構不發生改變D．僅設置一個對照組不能排除二苯胺加熱后可能變藍的干擾解析：DNA的提取過程中可以不使用離心機，可將研磨液過濾后在4℃冰箱中放置幾分鐘后，直接取上清液放入燒杯中，A正確，B錯誤；鑒定過程需要沸水浴加熱，DNA分子在高溫下會解螺旋，雙螺旋結構會發生改變，C錯誤；設置一個對照組可以排除二苯胺加熱后可能變藍的干擾，D錯誤。[例11]

(不定項)多種實驗材料都可以用于DNA的粗提取與鑒定，用香蕉也可以取得較好的實驗效果。下列敘述錯誤的是(

)A．研磨液可通過離心去除固體雜物B．冷卻的體積分數為95%的酒精可以溶解某些蛋白質，得到粗提取的DNAC．向剪碎的香蕉果肉組織中加入蒸餾水并研磨，以釋放核DNAD．將DNA溶于NaCl溶液后加入現配的二苯胺試劑，沸水浴后會出現藍色課時作業03題號12345678910111213難度★★★★★★★★★★★★★★★★★★★對點質粒基因表達載體的構建PCRPCR基因工程基本操作程序基因工程基本操作程序DNA粗提取與鑒定實驗DNA片段酶切電泳結果分析農桿菌轉化法基因工程基本操作程序基因工程基本操作程序基因工程基本操作程序基因工程基本操作程序1．大腸桿菌的質粒——環狀DNA是基因工程的常用載體，結構如圖。下列敘述正確的是(

)A．①②③共同組成核糖核苷酸B．質粒中的堿基遵循堿基互補配對原則C．DNA連接酶會使化學鍵④重新連接D．若某種限制酶在質粒上只有一個限制酶切割位點，則質粒被切為兩個片段解析：①②③共同組成DNA的基本單位——脫氧核苷酸，A錯誤；質粒中的堿基遵循堿基互補配對原則，A與T配對，G與C配對，B正確；限制酶識別特定序列并在特定位點切割，環狀質粒上若只有一個限制酶切割位點，則質粒被切割為1個完整的DNA鏈狀片段，D錯誤。A．其中一個引物序列為5′－TGCGCAGT－3′B．步驟①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠC．用步驟①的酶對載體進行酶切，至少獲得了2個片段D．酶切片段和載體連接時，可使用E.coli連接酶或T4連接酶2．(2023·重慶，12)某小組通過PCR[假設引物長度為8個堿基(短于實際長度)]獲得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶進行酶切(如圖)，再用所得片段成功構建了基因表達載體。下列敘述錯誤的是(

)解析：由于引物只能引導子鏈從5′到3′合成，分析圖中擴增獲得的DNA片段可知，其中一個引物序列為5′－TGCGCAGT－3′，A正確；根據三種限制酶的識別序列和酶切后的DNA片段左右側的黏性末端可知，步驟①所用的酶是NheⅠ和CfoⅠ，B錯誤；用步驟①的兩種酶對載體進行酶切，至少切斷2處，切割之后至少獲得了2個片段，C正確；圖中形成的是黏性末端，E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶對黏性末端均可連接，D正確。3．農桿菌Ti質粒上的T-DNA可以轉移并隨機插入到被侵染植物的染色體DNA中。研究者將下圖中被侵染植物的DNA片段連接成環，并以此環為模板進行PCR，擴增出T-DNA插入位置兩側的未知序列，以此可確定T-DNA插入的具體位置。下列說法不正確的是(

)注：子鏈從引物的3′端開始延伸。A．PCR擴增依據的是DNA分子半保留復制的原理B．進行PCR擴增需要耐高溫的DNA聚合酶C．利用圖中的引物②、③組合可擴增出兩側的未知序列D．通過與受體細胞的基因組序列比對，可確定T-DNA的插入位置解析：PCR擴增依據的是DNA分子半保留復制的原理，是體外擴增DNA的一種方式，A正確；PCR技術需要在高溫條件下進行變性，故進行PCR擴增需要耐高溫的DNA聚合酶，B正確；由于DNA的兩條鏈反向平行，且子鏈從引物的3′端開始延伸，故利用圖中的引物①、④組合可擴增出兩側的未知序列，C錯誤；通過與受體細胞的基因組序列比對，可確定T-DNA的插入位置，D正確。B．在第三輪循環產物中開始出現兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段C．引物之間或引物自身發生堿基互補配對，則不能有效擴增目的基因D．從理論上推測，第三輪循環產物中含有引物A的DNA片段占15/164．如圖表示利用PCR技術擴增目的基因的部分過程，其原理與細胞內DNA復制類似。下列敘述錯誤的是(

)A．耐高溫的DNA聚合酶總將游離的脫氧核苷酸連接到3′端解析：由于復制過程中子鏈的合成方向是從5′端向3′端，所以耐高溫的DNA聚合酶總將游離的脫氧核苷酸連接到3′端，A正確；圖中的引物A和引物B均不在該片段的端點，復制出的子鏈的長短從引物開始一直延伸至模板鏈的末端，在第二輪復制中才會出現兩個引物之間的單鏈，以此單鏈為模板在第三輪循環產物中可出現兩條核苷酸鏈等長的DNA片段，即引物之間的核苷酸序列，B正確；如果引物之間或引物自身發生堿基互補配對則會降低與模板鏈結合的效率，因此不能有效擴增目的基因，C正確；第三輪擴增共形成8個DNA分子，共16條鏈，除去原來的模板鏈，應該有新形成的14條鏈，且這14條鏈中均含有引物，兩種引物使用的頻率是相同的，即有7條單鏈含有引物A，每一條單鏈參與組成1個DNA分子，因此第三輪循環產物中含有引物A的DNA片段占7/8，D錯誤。A．構建基因表達載體時，最好選擇限制酶Ⅱ和Ⅲ來切割質粒B．利用PCR擴增抗凍基因，需提前檢測抗凍基因的全部堿基序列C．Vir區的基因活化促進抗凍基因整合到千禧果細胞的染色體DNA上D．利用含卡那霉素的培養基可篩選出成功導入抗凍基因的千禧果細胞5．科研人員將寒帶地區海魚中的抗凍基因轉入千禧果細胞中，成功培育出抗凍千禧果。右圖為培育過程中使用的Ti質粒示意圖，其中Vir區的基因活化能促進T-DNA的加工和轉移，下列敘述正確的是(

)解析：使用限制酶Ⅱ會破壞Vir區的基因，Vir區的基因活化能促進T-DNA的加工和轉移，是T-DNA轉移整合到受體細胞DNA上必不可少的，不能選限制酶Ⅱ，A錯誤；使用PCR技術擴增抗凍基因，只需要知道抗凍基因兩端堿基序列即可，B錯誤；農桿菌侵染植物細胞后，Ti質粒上的T-DNA能轉移到被侵染的細胞并整合到該細胞的染色體DNA上，所以Vir區的基因活化可促進抗凍基因整合到千禧果細胞的染色體DNA上，C正確；在培養基中添加四環素，可以篩選成功導入抗凍基因的千禧果細胞，卡那霉素抗性基因位于T-DNA之外，不會插入千禧果細胞染色體上，D錯誤。6．科學家將常年生活在寒帶的比目魚中的抗凍基因轉移到西紅柿里，培育出了抗凍番茄，這種西紅柿可以在冬季或較寒冷的地區種植，使得人們一年四季都能吃到西紅柿。如圖為含抗凍基因的外源DNA和質粒DNA的有關信息，其中EcoRⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、XhoⅠ均為限制酶，下列敘述中錯誤的是(

)A．構建基因表達載體時，應用BamHⅠ和XhoⅠ分別切割抗凍基因和質粒B．通過構建基因表達載體，可使目的基因在受體細胞中穩定存在C．導入抗凍基因的番茄細胞能在含四環素和卡那霉素的培養基上形成愈傷組織D．可以將轉基因番茄種在寒冷條件下，以便篩選出具有抗凍性狀的番茄植株解析：據圖可知，選擇限制酶SalⅠ會破壞目的基因，故右端只能選擇限制酶XhoⅠ，但該酶會破壞卡那霉素抗性基因，則應保證四環素抗性基因的完整性，則不能選擇EcoRⅠ，故構建基因表達載體時，應選擇用限制酶BamHⅠ和XhoⅠ分別切割抗凍基因和質粒，A正確；通過構建基因表達載體，可使目的基因在受體細胞中穩定存在，B正確；由于基因表達載體上的卡那霉素基因已被破壞，故含有抗凍基因的番茄細胞并不具有卡那霉素的抗性，因此導入抗凍基因的番茄細胞不能在含卡那霉素的培養基上形成愈傷組織，C錯誤；可以將轉基因番茄種在寒冷條件下，以便篩選出具有抗凍性狀的番茄植株，該鑒定方法是個體生物學水平的鑒定，D正確。7．(2023·廣東，11)“DNA粗提取與鑒定”實驗的基本過程是：裂解→分離→沉淀→鑒定。下列敘述錯誤的是(

)A．裂解：使細胞破裂釋放出DNA等物質B．分離：可去除混合物中的多糖、蛋白質等C．沉淀：可反復多次以提高DNA的純度D．鑒定：加入二苯胺試劑后即呈現藍色解析：進行DNA鑒定時可以使用二苯胺試劑，但要進行沸水浴加熱后才能觀察到顏色變化，D錯誤。8．XhoⅠ和SalⅠ是兩種限制酶，某段DNA上的酶切位點如圖1所示，用此兩種酶分別處理該DNA片段一段時間，電泳后的結果如圖2所示。下列敘述，錯誤的是(

)A．圖1中兩種限制酶識別的脫氧核苷酸序列不同B．泳道①是使用XhoⅠ處理后的酶切產物的電泳結果C．圖2中電泳移動速度最慢的是泳道②最上方的那條帶D．同時使用SalⅠ和XhoⅠ處理，酶切產物的電泳結果為7條條帶解析：不同的限制酶識別并切割的脫氧核苷酸序列不同，圖1中兩種酶識別的脫氧核苷酸序列不同，A正確；根據圖2分析泳道①中是用SalⅠ處理(其有3處切割位點，切割后產生4個DNA片段)得到的酶切產物，B錯誤；電泳移動速度快慢主要與DNA片段大小有關，泳道②最上方的那條帶離點樣孔最近，所以移動速度最慢，C正確；由題圖可知，若用SalⅠ和XhoⅠ同時切割該DNA，該DNA的每個酶切位點都會被切開，則將被切成6個片段，如果6個片段分子大小不同則在泳道中出現6條條帶，如果其中有片段分子大小相同，則條帶數目小于6條，D錯誤。9．為使玉米獲得抗除草劑性狀，需進行如圖所示的操作。報告基因的產物能催化無色物質K呈現藍色。轉化過程中，愈傷組織表面常殘留農桿菌，導致未轉化愈傷組織也可能在選擇培養基上生長。下列敘述正確的是(

)A．篩選1需要用氨芐青霉素培養基篩選成功導入表達載體的農桿菌B．篩選2需要用無色物質K處理愈傷組織并篩選出呈現藍色的組織C．報告基因在玉米的愈傷組織和農桿菌細胞中均能正確表達D．誘導幼胚脫分化形成愈傷組織的培養基需添加植物激素解析：據圖分析可知，質粒上含有氨芐青霉素抗性基因，可以作為標記基因，因此篩選1需要用氨芐青霉素培養基篩選成功導入表達載體的農桿菌，A正確；根據提供信息可知，報告基因的產物能催化無色物質K呈現藍色，因此篩選2需要用無色物質K處理愈傷組織并篩選出呈現藍色的組織，B正確；Ti質粒上的報告基因含有內含子，作為原核生物的農桿菌不具備切割內含子的能力，因此具有內含子的報告基因無法在農桿菌細胞中正確表達，C錯誤；植物組織培養過程包括脫分化和再分化過程，兩個過程都需要加入植物激素，D正確。B．在培養基中添加卡那霉素初步篩選導入重組質粒的農桿菌C．用農桿菌轉化植物愈傷組織選擇呈現藍色的組織進行培養D．啟動子若為除草劑誘導啟動子將減少細胞物質和能量浪費10．如圖為構建苘麻抗除草劑基因A重組質粒的技術流程，其中NptⅡ是卡那霉素抗性基因，GUS基因僅在真核細胞中表達，表達產物可催化底物呈藍色。下列說法正確的是(

)A．PCR擴增A時可在引物中加入PstⅠ和XhoⅠ的酶切位點解析：由圖可知，A基因插入到了質粒的PstⅠ和XhoⅠ的酶切位點之間，因此PCR擴增A時，需在其兩側加入PstⅠ和XhoⅠ的酶切位點，A正確；重組質粒中含有卡那霉素抗性基因，因此可以用含卡那霉素的培養基初步篩選導入重組質粒的農桿菌，B正確；由題可知，GUS基因表達產物可催化底物呈藍色，但是重組質粒中不含GUS基因，導入重組質粒的愈傷組織中也不含該基因，故不會出現藍色組織，C錯誤；A為抗除草劑基因，若啟動子為除草劑誘導啟動子，即只有在除草劑存在的情況下才誘導其表達，沒有除草劑時不表達，這就減少了細胞物質和能量的浪費，D正確。(1)圖a中，構建基因表達載體時用到的酶是____________________，片段X是__________。11．(2025·八省聯考山西、陜西、寧夏、青海)科研人員基于合成生物學原理在大腸桿菌中構建了合成產物Z的完整途徑，其基因表達載體如圖a，基因1、2和3為該途徑的必需基因，基因大小分別為2650bp、1240bp和3476bp。回答下列問題。限制酶、DNA連接酶復制原點(2)基因表達載體導入大腸桿菌前，需要用Ca2＋處理大腸桿菌使其處于一種________________________的生理狀態，導入后在含卡那霉素的培養基上篩選到3個抗性菌落，分別對其所含DNA進行能吸收周圍環境中DNA分子PCR和瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖b。據圖可知，PCR時選用的引物對是圖a中的______________，選擇該引物對進行鑒定的原因是______________________________________________________________；菌落B中未檢測到目標條帶，其原因是_____________________________________。引物2和引物5兩種引物擴增的區段包含了完整的基因2以及基因1和基因3的部分片段菌落B中導入的是普通質粒而非重組質粒(3)工程菌株合成產物Z的產量受到溫度、pH和溶解氧等發酵條件的影響，請針對其中任一因素，探究其對產物Z產量的影響，寫出簡要的實驗思路_________________________________________________________________________________________________________________________________。將工程菌株隨機分成若干份，分別培養在一系列不同溫度(或pH或溶解氧)的培養液中，其他環境條件相同且適宜，一段時間后測定產物Z的產量解析：(2)電泳檢測的目的是判斷3個抗性菌落是否都含有目的基因(基因1、2和3)，電泳結果顯示，菌落A和C電泳條帶顯示基因大小介于2000～3000之間，結合目的基因上的引物分析，應該選擇引物2和引物5，兩種引物擴增了基因2(1240bp)以及基因1和基因3的部分片段，片段大小應該在2000～3000之間，且兩種引物擴增的區段包含了完整的基因2以及基因1和基因3的部分片段，這樣可以很好的判斷大腸桿菌中是否成功導入了目的基因。菌落B中未檢測到目標條帶，即不含目的基因但含抗性基因，其原因是菌落B中導入的是普通質粒而非重組質粒。(3)本實驗的實驗目的是探究溫度、pH和溶解氧等發酵條件對產物Z產量的影響，實驗自變量是溫度或pH或溶解氧，檢測指標是產物Z產量。12．(2025·八省聯考四川)細菌中的蛋白激酶Y感受外界刺激后，利用ATP將特異性底物A蛋白磷酸化，改變A蛋白的活性從而應答外界刺激，調控細菌的生長。研究者將Y基因(編碼蛋白激酶Y)與GFP基因(編碼綠色熒光蛋白)拼接成Y－GFP融合基因(Y－GFP基因)，導入載體，并表達出融合蛋白(Y－GFP蛋白)，以分析蛋白激酶Y的功能，實驗過程如圖所示。回答下列問題。(1)Y基因含有735個堿基對(bp)，其編碼的肽鏈含有____個氨基酸。通過PCR分別擴增Y基因與GFP基因，配制的兩個反應體系中不同的有____(填標號)。a．模板 b．引物c．DNA聚合酶 d．反應緩沖液(2)構建Y基因與GFP基因的融合基因時，應將Y基因中編碼終止密碼子的序列刪除，理由是___________________________________________________________。245ab核糖體移動到終止密碼子多肽鏈就斷開，蛋白GFP就不能翻譯出來(3)據圖步驟一分析，為確保Y－GFP基因插入載體后完整表達，在構建重組基因表達載體時不能選擇EcoRⅠ限制酶，理由是_______________________________________