DB15∕T 3534-2024 籽用西葫蘆葉片三種病毒RT-PCR檢測技術規程

ICS65.020.01

CCSB04

15

內蒙古自治區地方標準

DB15/T3534—2024

籽用西葫蘆葉片三種病毒RT-PCR檢測

技術規程

TechnicalcodeofpracticeforRT-PCRdetectionofthreeviruses

fromleavesofseed-usedpumpkin(CucurbitapepoL.)

2024-06-28發布2024-07-28實施

內蒙古自治區市場監督管理局發布

DB15/T3534—2024

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定

起草。

本文件由內蒙古自治區農牧廳提出。

本文件由內蒙古自治區果蔬標準化技術委員會（SAM/TC25）歸口。

本文件起草單位：內蒙古農業大學、內蒙古弘昌農業有限責任公司、呼和浩市農牧技術推廣中心。

本文件主要起草人：王萍、龍建國、劉杰才、陳貴華、蘇利民、孫婧、許珂、尚鵬。

I

DB15/T3534—2024

籽用西葫蘆葉片三種病毒RT-PCR檢測技術規程

1范圍

本文件規定了籽用西葫蘆葉片三種病毒RT-PCR檢測技術中涉及的術語和定義、試劑與材料、儀器和

設備、對照設置、樣品采集、樣品病毒檢測、結果分析。

本文件適用于籽用西葫蘆葉片中黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）、西瓜花葉病毒

（Watermelonmosaicvirus，WMV）、小西葫蘆黃化花葉病毒（Zucchiniyellowmosaicvirus，ZYMV）

的RT-PCR檢測。

2規范性引用文件

本文件沒有規范性引用文件。

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

黃瓜花葉病毒Cucumbermosaicvirus

屬于雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）黃瓜花葉病毒（Cucumovirus），可以侵染1000多種植物。

主要通過蚜蟲以非持久方式傳播，也是典型的種傳病毒。黃瓜花葉病毒一般為系統侵染植物，主要表現

為葉片斑駁花葉，葉肉淺綠，葉脈深綠；嚴重時呈現葉片皺縮，葉肉退化，蕨葉等癥狀。

西瓜花葉病毒Watermelonmosaicvirus

屬于馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus），在自然界中通過蚜蟲以非持久

性方式傳播，也可經汁液摩擦接種傳播。受侵染的病株葉片表現花葉、畸形、新生葉片扭曲，植株生長

受阻，果實畸形。

小西葫蘆黃化花葉病毒Zucchiniyellowmosaicvirus

屬于馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus），可由多種蚜蟲以非持久性方式

傳播，也能通過種子傳播。小西葫蘆黃化花葉病毒表現為系統侵染，整株花葉、黃化、葉片皺縮、果實

畸形、表面有泡狀或者瘤狀突起。

4試劑與材料

1

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試劑

瓊脂糖、核酸染料、PremixTaq酶、TRIzol試劑、PCR產物回收試劑盒、TransScriptOne-StepgDNA

RemovalandcDNASynthesisSuperMix試劑盒、pMD18-T載體、大腸桿菌感受態細胞DH5a、DNA分子量

標準：可以清楚區分100bp～500bp的DNA片段。

溶液配制

4.2.110mol/L氫氧化鈉(NaOH)溶液：在160mL水中加入80.0g氫氧化鈉，溶解后，冷卻至室溫，

再加水定容至200mL。

4.2.20.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)溶液(pH8.0)：稱取18.6g乙二胺四乙酸二鈉，加入

70mL水中，緩慢滴加氫氧化鈉溶液(見4.3)直至EDTA-Na2完全溶解，用氫氧化鈉溶液(見4.3)調pH

至8.0加水定容至100mL。在121℃條件下滅菌20min。

4.2.31mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCL)溶液(pH8.0)：稱取121.1g三羥甲基氨基甲烷溶

解于800mL水中，用鹽酸調pH至8.0加水定容至1000mL。在121℃條件下滅菌20min。

4.2.4TE緩沖液(pH8.0)：分別量取10mL三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液(見4.5)和2mL乙二胺四乙

酸二鈉溶液(見4.4)，加水定容至1000mL。在121℃條件下滅菌20min。

4.2.550×TAE緩沖液：稱取242.2g三羥甲基氨基甲烷(Tris)，先用500mL水加熱攪拌溶解后，加

入100mL乙二胺四乙酸二鈉溶液(見4.4)，用冰乙酸調pH至8.0，然后加水定容至1000mL。使用時

用水稀釋成1×TAE。

4.2.6加樣緩沖液：稱取250.0mg溴酚藍，加入10mL水，在室溫下溶解12h；稱取250.0mg二甲

基苯腈藍，加10mL水溶解；稱取50.0g蔗糖，加30mL水溶解。混合以上3種溶液，加水定容至100

mL，在4℃下保存。

4.2.7CMV病毒檢測上游引物CMV-F:5’-TTCGATAAGAAGCTTGTTTCGCG-3’，下游引物CMV-R:5’-

AGACGTGGGAATGCGTTGGTGCT-3’。預期擴增目的片段大小為345bp(參見附錄A中的A.1)。

4.2.8WMV病毒檢測上游引物WMV-F:5’-CCAGTGGCAAAGGTGATA-3’，下游引物WMV-R:5’-

TGCTGCGTCTGAGAAATG-3’。預期擴增目的片段大小為435bp(參見附錄A中的A.2)。

4.2.9ZYMV病毒檢測上游引物ZYMV-F:5’-ATGCAGAGGCACCATACAT-3’，下游引物ZYMV-R:5’-

TACTGCATTGTGTTCACACC-3’。預期擴增目的片段大小為283bp(參見附錄A中的A.2)。

4.2.10引物溶液：用TE緩沖液（見4.6）將上述引物稀釋到10μmol/L。

5儀器和設備

分析天平、組織研磨儀、PCR擴增儀、電泳槽、電泳儀等電泳裝置、Nanodrop微量分光光度計、凝

膠成像系統或照相系統、切膠儀、離心機。

6對照設置

陽性對照

以通過RT-PCR擴增和測序分析明確含有CMV、WMV、ZYMV的樣品為陽性對照。

陰性對照

通過RT-PCR擴增明確不含有CMV、WMV、ZYMV的樣品為陰性對照。

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DB15/T3534—2024

空白對照

以滅菌ddH2O作為模板進行PCR擴增的產物為空白對照。

7樣品采集

采集有明顯癥狀的疑似病毒感染的籽用西葫蘆葉片，放入自封袋中封口后，快速冷凍于液氮或干冰

中，進行檢測分析。如需長期保存可置于-80℃冰箱中。樣品應避免交叉污染。

8樣品病毒檢測

重復次數

每個對照和試樣設置2次重復。

RNA提取和質量檢測

8.2.1RNA提取：將樣品在液氮下研磨至粉狀后稱取0.1g，置于滅菌2mL離心管中，加入1mLTRIzol

試劑后混勻，提取總RNA。

8.2.2RNA濃度檢測：提取的樣品總RNA用Nanodrop微量分光光度計測定RNA相對濃度，當OD260/OD280

比值為1.8～2.0時，可用于RT-PCR檢測。

8.2.3RNA完整性檢測：取2μLRNA與4μL加樣緩沖液混合后，加入凝膠點樣孔，進行電泳檢測。

電泳結束后，觀察結果（參見附錄B.1）。如果總RNA條帶清楚，就可以用于后續實驗。

反轉錄

在離心管中加入1μgRNA模板，1μLAnchoredOligo（dT）18引物和RNase-FreeddH2O，混勻，

65℃孵育5min，冰浴2min。然后加入10μL2×TS反應液，1μL反轉錄酶和1μLgDNARemover，

輕輕混勻，42℃孵育30min。85℃加熱5sec終止反應，-20℃冰箱保存備用。

PCR擴增

8.4.1在PCR管中按表1依次加入反應試劑，混勻。

表1PCR擴增體系

試劑體積

PremixTaq25μL

cDNA2μL

10μmol/L上游引物1μL

10μmol/L下游引物1μL

ddH2O補足50μL

8.4.2將PCR管放入離心機中，瞬時離心2sec，取出PCR管，放入PCR儀中。

8.4.3PCR反應程序：94℃預變性3min；94℃變性30sec，退火30sec（CMV58℃，WMV50℃，

ZYMV50℃），72℃延伸1min，35個循環；72℃延伸10min，4℃保存。

8.4.4反應結束后取出PCR管，對PCR擴增產物進行電泳檢測。

瓊脂糖凝膠電泳檢測

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DB15/T3534—2024

8.5.1稱量1g瓊脂糖加入到100mL1×TAE緩沖液中，加熱混勻。冷卻后加入8μL核酸染料，混

勻，將其倒入電泳槽，插上梳板。室溫下凝固成凝膠后，倒入1×TAE緩沖液中，垂直向上輕輕拔去梳

板。取5μLPCR產物與10μL加樣緩沖液混合后，加入凝膠點樣孔，同時在其中一個點樣孔加入DNA

分子量標準，進行電泳檢測。

8.5.2電泳結束后，取出瓊脂糖凝膠，置于凝膠成像儀上成像，進行結果分析。

測序驗證

PCR產物用凝膠回收試劑盒純化目的片段，并在4℃連接至pMD18-T載體，轉化到大腸桿菌感受態

細胞DH5a，經藍白斑篩選，挑取陽性克隆，送至公司測序。獲得的序列與NCBI數據庫的CMV、WMV、ZYMV

病毒序列(參見附錄A)比對，確定PCR擴增的DNA片段是否為目的DNA片段。

9結果分析

參見附錄B.2,陽性對照CMV在345bp、WMV在485bp、ZYMV在283bp處有目標條帶，陰性和空

白對照無條帶，判定結果有效。陽性對照無條帶或陰性和空白對照有條帶，判定結果無效，需要重復檢

測。當結果有效時，試樣檢測出目標條帶判定為病毒感染。

4

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A

A

附錄A

（資料性）

籽用西葫蘆葉片CMV/WMV/ZYMV特異性片段序列

A.1CMV特異性片段序列

A.2WMV特異性片段序列

A.3ZYMV特異性片段序列

注1：序列方向為5’-3’。

注2：5’下劃線為PCR上游引物序列，3’下劃線為PCR下游引物的反向互補序列。

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B

B

附錄B

（資料性）

籽用西葫蘆葉片CMV/WMV/ZYMV的RT-PCR檢測電泳圖

B.1籽用西葫蘆葉片總RNA電泳圖譜見圖B.1。

圖B.1籽用西葫蘆葉片總RNA電泳圖

B.2籽用西葫蘆葉片病毒RT-PCR檢測電泳圖見圖B.2。

CMV