腫瘤細胞與分化、凋亡-三課件

細胞凋亡的生物學意義

胚胎發育和形態發生細胞穩態和免疫機制衰老腫瘤發生及化學治療

腫瘤細胞與分化、凋亡-三細胞凋亡和惡性腫瘤1Bcl－2和惡性腫瘤2P53和惡性腫瘤3Bcr-abl和惡性腫瘤4PML-RARα蛋白和惡性腫瘤腫瘤細胞與分化、凋亡-三細胞凋亡干預和腫瘤治療1野生型P53基因介導的腫瘤治療2Bcl－2基因介導的腫瘤治療3泛素－蛋白酶體降解途徑介導的腫瘤治療4三氧化二砷介導的血液系統惡性腫瘤治療5DADS誘導腫瘤細胞凋亡腫瘤細胞與分化、凋亡-三細胞凋亡的檢測方法1臺肦藍（trypanblue)染色法原理：trypanblue是一種細胞膜非通透性染料。壞死細胞因細胞膜受損而被臺肦藍著色染色。因此，該法能區分細胞的生存狀態，簡單、便捷、常規用于細胞死亡的初步評價和細胞存活率評價。注意事項：該法不能區別繼發性壞死和真正意義上的壞死細胞；也容易低估細胞死亡程度。（因為早期凋亡細胞具有完整的細胞膜而被誤當作活細胞）腫瘤細胞與分化、凋亡-三2.丫啶橙染色（acridineorange,

AO)和溴化乙啶(ethidiumbromide,

EB)雙染法

原理：AO和EB都是結合DNA的熒光染料，分別產生藍色和橙色熒光。其中，AO能透過完整的細胞膜，而EB則只能染色胞膜受損的細胞。因此，AO/EB雙染法能借助熒光顯微鏡或流式細胞儀區分活細胞或早期凋亡細胞和壞死或繼發性壞死細胞。

注意事項：應用單一形態學計數凋亡細胞數（凋亡指數，apoptosisindex)常受到主觀因素的干擾，其個體間甚至同一主體的重復性較差。

腫瘤細胞與分化、凋亡-三熒光顯微鏡觀察

圖9A未處理的HL-60細胞圖9BDADS處理的HL-60細胞吖啶橙×40吖啶橙×40腫瘤細胞與分化、凋亡-三3電子顯微鏡觀察法

電鏡下超微結構觀察雖可顯示凋亡細胞的許多特點，如膜發泡和某些結構如微纖毛的丟失、染色質固縮和線粒體超濃縮等，但由于樣本制備復雜、耗時，該項技術主要用于獲取細胞凋亡的定性檢測。腫瘤細胞與分化、凋亡-三腫瘤細胞與分化、凋亡-三3透射電鏡觀察

圖8A未處理的HL-60細胞圖8BDADS處理的HL-60細胞透射電鏡×6000透射電鏡×6000腫瘤細胞與分化、凋亡-三4DNA斷片法或稱瓊脂糖凝膠電泳“梯形條帶”圖譜法

原理：凋亡細胞的基因組DNA常首先被剪切為200-300kb和30-50kb的片斷（“結構域式”剪切），再進一步降解產生大小相當于核小體(160-200bp)的倍數的寡核小體片斷（“裂解”/“梯子式”剪切）。因此，在瓊脂糖凝膠電泳圖譜上凋亡細胞表現為特征性“梯子”樣外觀。注意事項：梯狀DNA(DNAladder)現象常被看作是細胞凋亡的重要生物化學標志。但是，日益增多的資料顯示并不是所有表現凋亡形態學特征的細胞都是呈現這種梯子樣外觀。因此，缺乏梯狀DNA并不能排除細胞凋亡的存在。據報道，某些細胞系如K562細胞凋亡常發生單鏈而不是雙鏈DNA降解，故不能形成“DNAladder”。另外，一般凋亡率要在15%以上才能呈現典型“DNAladder”。故有DNAladder可以肯定凋亡存在，沒有DNA

ladder不能排除凋亡的存在。腫瘤細胞與分化、凋亡-三圖5不同濃度DADS作用HL-60細胞24h后DNA梯狀條帶的形成圖660μmol·L-1

DADS作用HL-60細胞不同時間后DNA梯狀條帶的形成腫瘤細胞與分化、凋亡-三５.TUNEL法（末端DNA轉移酶dUTP缺口末端標記法）

原理：DNA聚合酶能夠填補雙鏈DNA中的單鏈缺失部分，應用放射性同位素、生物素和熒光素等標記的三磷酸核苷酸形成新的DNA。TUNEL法是在含標記dUTP的反應體系中，加以末端DNA轉移酶。故又稱為TdT(terminaldeoxy-transferase)法。該法是應用無需模板的DNA聚合酶，延伸核苷酸的堿基序列與DNA底物無關。注意事項：該法只能了解DNA是否斷裂和發生DNA斷裂的細胞數量，雖然在理論上對這種方法的特異性尚有爭議，但操作簡便，并且可大量應用于回顧性研究，從而成為目前較為流行的細胞凋亡評價方法。腫瘤細胞與分化、凋亡-三TUNEL檢測結果

圖10A未處理的HL-60細胞圖10BDADS處理的HL-60細胞

TUNEL×20TUNEL×20腫瘤細胞與分化、凋亡-三6PI染色流式細胞術測定凋亡率

原理：實驗證明凋亡細胞在固定和清洗過程中降解的小分子量DNA外漏，導致細胞內DNA含量減少。因此，應用DNA特異熒光染料（如碘化丙啶，propidiumiodide,PI）染色后，在FCM進行的細胞周期分析中，凋亡細胞常以亞二聚體形式出現。亞二倍體細胞群被稱為亞G1期（sub-G1)細胞。它的出現被認為是凋亡細胞的重要標志。注意事項：識別亞G1期細胞的同時，必須將它和細胞碎片區分開來，因為細胞碎片的DNA含量也明顯低于G1期細胞。腫瘤細胞與分化、凋亡-三2.3流式細胞儀檢測凋亡率

control5mg·L-1DADS7.5mg·L-1DADS10mg·L-1DADS15mg·L-1DADS20mg·L-1DADS10mg·L-1DADS+PD10mg·L-1DADS+SB腫瘤細胞與分化、凋亡-三圖7PI/AnnexinV雙染色檢測DADS作用HL-60細胞12h后凋亡率的變化腫瘤細胞與分化、凋亡-三3.3流式細胞儀檢測凋亡率

腫瘤細胞與分化、凋亡-三圖12PI/Anexin-V雙染色流式細胞儀檢測DADS作用K562細胞12h后凋亡率的改變腫瘤細胞與分化、凋亡-三EFGH圖13流式細胞儀檢測DADS作用K562細胞24h、48h后的凋亡率改變腫瘤細胞與分化、凋亡-三細胞凋亡死亡受體相關信號途徑

腫瘤細胞與分化、凋亡-三細胞凋亡死亡受體相關信號途徑

表3caspase家族主要成員序號原名功能底物特異性Caspase-1ICE輔助炎癥WEHDCaspase-2ICH-1凋亡反應DEXDCaspase-3CPP32,Yama,apopain凋亡反應DEXDCaspase-4ICErel-Ⅱ,TX,ICH-2輔助促炎癥WEHDCaspase-5ICErel-Ⅲ,TY輔助促炎癥WEHDCaspase-6Mch-3凋亡反應(I/L/V)EXDCaspase-7Mch-3,ICE-LAP3,CMH-1凋亡反應DEXDCaspase-8FLICE,MACH,Mch-5凋亡反應(I/L/V)EXDCaspase-9ICE-LAP6.Mch6凋亡反應(I/L/V)EXDCaspase-10Mch4凋亡反應Caspase-11ICH-3Caspase-12Caspase-13ERICHCaspase-14MICE(Mini-ICE)腫瘤細胞與分化、凋亡-三Pro-caspase3Pro-caspase9Cyt-cGAPDHHL-60

Time(h)01

24824圖30DADS作用HL-60細胞后caspase3的表達變化腫瘤細胞與分化、凋亡-三Pro-caspase3Pro-caspase9Cyt-cGAPDHK562

Time(h)0

1

24

8

24圖31DADS作用K562細胞后caspase3的表達變化腫瘤細胞與分化、凋亡-三Pro-caspase3Pro-caspase9Cyt-cGAPDHRaji

Time(h)01

2

48

24圖32DADS作用Raji細胞后caspase3的表達變化腫瘤細胞與分化、凋亡-三細胞凋亡線粒體相關信號途徑MMP開放線粒體外膜PBRCyclophilinDANTPorin△φm

下降AIFCytoC/Apaf-1/procaspase-9caspase-9-caspase-8caspase-3apoptosis腫瘤細胞與分化、凋亡-三BaxMitoTrackeroverlay

圖34

激光共聚焦檢測HL-60細胞中Bax的線粒體轉位腫瘤細胞與分化、凋亡-三overlayMitoTrackerBax

圖35激光共聚焦檢測K562細胞中Bax的線粒體轉位腫瘤細胞與分化、凋亡-三DADS通過啟動Mcl-1/Bid/Bax/Caspase-9/Caspase-3線粒體凋亡通路誘導HL-60和K562細胞凋亡。腫瘤細胞與分化、凋亡-三MMP開放和caspase活化的“正反饋”環MMP開放Caspase-3活化線粒體膜屏障功能破壞線粒體腫脹CyotoC釋放Apoptosome（procaspase-9/Apaf-1/CytoC）Caspase-9活化膜間蛋白（如AIF）釋放刺激ceremide酶活化剪切MMP復合物凋亡誘導劑結合Apaf-1和procaspase-9腫瘤細胞與分化、凋亡-三內源性細胞凋亡抑制物1Caspase－8（FLICE)抑制蛋白（FLIP)2SODD(silencerofdeathdomain)3IAP（inhibitorofapoptosisprotein)4Survivin5Bcl-2家族蛋白腫瘤細胞與分化、凋亡-三Bcl－2家族蛋白的結構和功能Bcl－2的兩大結構域：

TMBHBcl－2家族蛋白活性調節

Bcl－2家族蛋白的效應機制腫瘤細胞與分化、凋亡-三MCL1Bcl-2BidBaxBakGAPDHHL-60Time(h)0124824圖24DADS處理HL-60細胞后Bcl-2家族成員的表達變化腫瘤細胞與分化、凋亡-三GAPDHBakBaxBcl-2K562BidTime(h)0124824圖25DADS作用K562細胞后Bcl-2家族成員的表達變化MCL1腫瘤細胞與分化、凋亡-三Time(h)0124824MCL1Bcl-2BidBax