臨床基因擴增檢驗質量保證+課件

臨床基因擴增檢驗的

質量保證衛生部臨床檢驗中心National

Center

For

Clinical

Laboratories●為一產品或服務滿足特定質量要求提供充分可信性所必要的有計劃的和系統的措施。質量保證(QualityAssurance,QA)衛生部臨床檢驗中心National

Center

For

Clinical

Laboratories室內質量控制

(InternalQuality

Control,IQC)的概念●由實驗室工作人員，采取一定的方法和步驟，

連續評價本實驗室工作的可靠性程度，旨在監測和控制本實驗室工作的精密度，提高本室常規工作中批內、批間樣本檢驗的一致性，以確定測定結果是否可靠、可否發出報告的

—項工作。●

可概括為：(1)執行者：實驗室技術人員；(2)

目的：監測實驗室測定的重復性；(3)功能：

決定了當批測定的有效性，報告可否發出。是對實驗室測定的即時性評價。衛生部臨床檢驗中心NationalCenterForClinical

Laboratorien室間質量評價

(ExternalQualityAssessment,EQA)●

為客觀比較一實驗室的測定結果與靶值的差異，由外單位機

構

，采取一定的辦法，連續、客觀地評價實驗室的結果，

發現誤差并校正結果，使各實驗室之間的結果具有可比性。這是對實驗室操作和實驗方法的回顧性評價，而不是用來決定在實時的測定結果的可接受性。當EQA

用來為執業許可或實驗室認證的目的而評價實驗室操作時，常描述為實

驗室能力驗證

(Proficiency

testing,PT)。在以前的文獻

中

，EQA

常描述室間質量控制。衛生部臨床檢驗中心NationalCenterForClinical

Laboratorien批(Run)●

在相同條件下所獲得的一組測定。衛生部臨床檢驗中心NationalCenterForClinicalLaboratories●

正態分布(Gaussian

distribution)

當一

質控物用同一方法在不同的時間重復多

次測定，當測定數據足夠多時，如以橫

軸表示測定值，縱軸表示在大量測定中

相應測定值的個數，則可得到一個兩頭

低，中間高，中為所有測定值的均值，

左右對稱的“鐘形”曲線，亦即正態分

布，又稱高斯分布。定

義衛生部臨床檢驗中心NationalCenter

ForClinical

Laboratories正態分布的基本統計學含義可用均數(X)

、

標

準差

(s)和概率來說明。()X-3S

X+25

x-S

X

X+s

X+3S●

標本收集：選擇測定項目、標本收集和保存?！?/p>

實驗室測定：標本接收、貼標簽、樣本處理、核酸擴增、產物檢測、測定的有效性和臨床診療

價值。●

報告和解釋：結果發出、結果解釋和臨床管理。臨床基因擴增檢驗實驗室常規測定步驟衛生部臨床檢驗中心National

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Clinical

Laboratories質量保證、室內質控和室間質評之間的關系患者圖1

.

臨床檢馬驗中涉及的各-

步驟及其與質量控制的關系QAEQA標

本

接

收測

定

的

有

效

性

i臨

床

診

療

價

值貼上特定的實馬驗室標簽

測

定備

測

來保

擇者本本結果發

出

結

果

解

釋

臨

床

管

理標

本

收

實

驗

室轅晷

解釋定

集存選患標標項

目IQC集●標本收集●標本保存●標本運送臨床標本收集、運送、保存及其質量控制衛生部臨床檢驗中心National

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Clinical

Laboratories標本收集

●標本采集時間對擴增檢測結果的影響●

標本采集部位的準備●標本的類型和采集量●

采樣質量的評價●采樣及運輸容器●

標本采集中的防污染衛生部臨床檢驗中心National

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Clinical

Laboratories●在疾病發展過程中，標本采集過早或過晚都可能會給出假陰性結果。標本采集時間對擴增檢測結果的影響衛生部臨床檢驗中心NationalCenterForClinicalLaboratories●血液標本采集●分泌物標本：采集部位的清潔消毒

可去掉污染的微生物或其它雜物，

但應適度，過度清潔消毒有可能會

去掉或破壞靶微生物，故標本采集

部位的準備應由訓練有素的人員

進行。標本采集部位的準備衛生部臨床檢驗中心National

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Clinical

Laboratorien標本的類型和采集量●標本的類型：血清(漿)、分泌物、痰、

糞便、尿和腦脊液等。●

標本的采集量：應根據所測病原體而定。

一般來說，如果標本的量對病原體培

養夠用的話，則其量亦足以用于核酸

提取及其后的擴增檢測?！駥τ诙繙y定來說，對標本的收集要衛生部臨床檢驗中心NationalCenterForClinicalLaboratorien求更為精確。●分泌物、痰：評價內容包括細胞組成，

所需類型細胞的數量和核酸總量。評價方法：包括肉眼觀察，顯微鏡下觀察

和化學分析等。采樣質量的評價●血清(漿)標本：溶血、脂血等；衛生部臨床檢驗中心National

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Clinical

Laboratories采樣及運輸容器●標本的采集材料如棉簽應為一次性使

用；●采樣及運輸容器應為密閉的一次性無

菌裝置；●采樣所用的防腐劑、抗凝劑及相關試

劑材料不應對核酸擴增及檢測過程造衛生部臨床檢驗中心NationalCenterForClinicalLaboratorien成干擾?！癫杉幸貏e注意污染，防止混入

操作者的頭發、表皮細胞、痰液等；●如使用玻璃器皿，必須經高壓滅菌，

以使可能存在的RNase

失活。標本采集中的防污染衛生部臨床檢驗中心NationalCenter

ForClinical

Laboratorien標本保存●靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶

的作用而迅速降解，因此標本的

保存對于核酸擴增測定的有效性

極為重要?！袷褂肎ITC作為穩定劑保存標本，

標本可在室溫下穩定約7天。衛生部臨床檢驗中心National

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Clinical

Laboratorien標本保存

●

臨床體液標本長期保存應在-70℃下?！?/p>

如為提取核酸后用于DNA

擴增分析的樣

本，可于10mmol/L

Tris,1mmol/LEDTA(pH7.5～8.0)

緩沖液中4

℃下保存?！裼糜赗NA

擴增分析的樣本，則應于上述

緩沖液中-80℃或液氮下保存。●核酸的乙醇沉淀物則可于-20℃下保存。衛生部臨床檢驗中心National

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Clinical

Laboratories標本運送●樣本一經采集，則應盡可能快的送至檢

測實驗室。●

樣本中如加入了適當的穩定劑，如用于RNA測定加入GITC的血清(漿)樣本和用

于DNA測定的EDTA抗凝血等，則可在室

溫下運送或郵寄?！?/p>

實驗室應根據待測靶核酸的特性，對各

種臨床樣本的運送條件作出相應的規定。衛生部臨床檢驗中心National

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Clinical

Laboratories臨床基因擴增檢驗的室內質量控制

●測定前的質量控制●核酸樣本的制備及其質量控制●統計學質量控制●質量控制的評價衛生部臨床檢驗中心National

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Clinical

Laboratories測定前質量控制●實驗室設施、儀器設備及管理●理想的試劑和操作方法●人員培訓衛生部臨床檢驗中心National

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Clinical

Laboratories●臨床基因擴增檢驗實驗室應有充分合理

的空間、良好的照明和空調設備；●實驗室儀器設備應保養良好，實驗用品

要達到相應的要求。加樣器的校準?

帶

濾塞吸頭的使用及質檢?離心機?熱循

環儀?水浴箱和/或恒溫干浴儀?酶標儀和洗板機?衛生部臨床檢驗中心NationalCenterForClinicalLaboratorien實驗室設施、儀器設備及管理

產

物

分

析區空氣流向擴增區空氣流向標

本

制

備區空氣流向試

劑

準

備區空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向理想的核酸擴增實驗室設計A

衛生部臨床檢驗中心National

CenterForClinical

Laboratorien產

物

分

析區空氣流向擴增區空氣流向標

本

制

備區空氣流向試

劑

準

備區空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向理想的核酸擴增實驗室設計B衛生部臨床檢驗中心National

CenterForClinical

Laboratorien“十六字口訣”衛生部臨床檢驗中心National

Center

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Clinical

Laboratories●

各區獨立●

注意風向●

因地制宜●

方便工作核酸擴增檢測實驗室設計的一般原則擴增區門產物分析區門擴

增

及

產

物分析區門外走廊

門標本制備區

試劑準備區門門

外走廊

門衛生部臨床檢驗中心National

Center

For

Clinical

Laboratorien標本制備區門試劑準備區AB門標本制備區空氣流向

門擴

增

及

產物分析區空氣流向門空氣流向試劑準備區門衛生部臨床檢驗中心National

Center

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Clinical

Laboratorien擴增和產物分析區空氣流向其他實驗室試劑準備區空氣流向其他實驗室

其他實驗室走廊走廊其他實驗室空氣流向標本制備區其他實驗室其他實驗室其他實驗室衛生部臨床檢驗中心NationalCenterForClinical

Laboratorien其他實驗室走廊其他實驗室衛生部臨床檢驗中心NationalCenterForClinicalLaboratories標本制備區空氣流向+

門擴

增

及

產物分析區空氣流向++門空氣流向試劑準備區門空氣流向

走廊空氣流向+

其他實驗室標

本

制

備區物勢積音空氣流向++其他實驗室其他實驗室其他實驗室試劑準備區空氣流向其他實驗室門緩沖間

緩沖間工作流向衛生部臨床檢驗中心National

Center

For

Clinical

Laboratorien產物分析區擴增區傳遞窗空氣流向空氣流向緩沖間專用走廊標本制備區試劑準備區傳遞窗

傳遞窗空氣流向空氣流向“無基因”或

“無核酸”概念的重要性衛生部臨床檢驗中心NationalCenterForClinical

Laboratorien失控標準實驗失敗如靶溫度或溫度差異超出允許范圍待測孔未出現擴增，檢測溫度打印程序不對不符合要求不符合要求不符合要求衛生部臨床檢驗中心質控方法儀器校驗實驗熱電偶監測溫度擴增功能檢測程序打印校準溫度檢測預防性維護及校準頻

度當儀器移動時每月一次每4個月一次每次測定時

每年2次每次實驗每年2次基因擴增儀器設備的質控加樣器水浴箱酶標儀儀器設備擴增儀NationalCenterForClinicalLaboratories帶濾芯吸頭的使用及質檢●首先制備一個含1～2%甘油及色素(如甲基橙)的水溶液，如果吸頭

的最大體積為100

μl,則將加樣器吸

取體積調至110～120

μl,

再套上吸

頭后吸取上述有色液體。如果吸頭質量好，則有色液體不應出現在濾芯之上，否則說明濾芯不嚴。衛生部臨床檢驗中心NationalCenterForClinicalLaboratorien●離心管PCR

抑制物質檢●其他核酸提取用離心管質檢衛生部臨床檢驗中心NationalCenterForClinicalLaboratories●一是使用一種熱電偶探針、微伏轉換器和自動圖示記錄

儀組成擴增加熱模塊孔內溫度監測記錄系統，當孔間溫

度變異超出1℃時，其可測出來?！窬唧w做法是將裝有TE

緩沖液并上加石蠟油的擴增反應管

放置于擴增儀各孔中，熱電偶探針透過擴增反應管蓋插

至緩沖液中，然后按程序進行一個常規的PCR擴增，加

熱模塊如為96孔，則至少要測定12孔不同位置孔內的溫

度，在整個擴增過程中，可移動熱電偶探針至上述不同

孔中監測溫度，但每一孔內溫度監測至少要有一個擴增擴增儀孔間溫度的重復性和均一性

的檢測方法衛生部臨床檢驗中心NationalCenterForClinicalLaboratories周期。擴增儀孔間溫度的重復性和均一性

的檢測方法●第二種方法并非直接測定孔內溫度，而是通過

擴增功能來間接獲知孔間的均一性，即將加有

一已知的含一定濃度的陽性質控樣本的擴增反

應管置于擴增儀各孔中按常規進行擴增檢測，

觀察結果的一致性程度，如果有某一個或幾個

孔結果有問題，則應確定這一個或幾個孔是否

會重復性地得到假陰性結果，如果是，則表明

相應孔的熱傳導有損壞。衛生部臨床檢驗中心National

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Clinical

Laboratories●試劑盒的質檢●定量測定的精密度是測定組成步驟的變

異和的平方根(SD)=√

SD2+SD2+SD2+

…

…上式中SDa

、SD?

、SD.是步驟a

、b

、c

等

(例如試劑準備、標本采集、核酸提取、擴增和產物檢測等)的標準差理想的試劑和操作方法衛生部臨床檢驗中心NationalCenterForClinical

Laboratorien理想的試劑和操作方法●改善測定精密度的措施必須首先

著重在最不精密的步驟上，應對

試劑準備、標本收集、核酸提取、

測定方法和儀器操作寫出“標準

操作程序”(SOP)衛生部臨床檢驗中心NationalCenterForClinicalLaboratorien●

質量手冊●

質量體系程序文件●

標準操作程序(SOP)

(相關記錄表格、報告

)文件內容按確定的質量方針和目標以及

適用的相關認可標準描述質量體

系描述為實施質量體系要素所涉

及到的各職能部門的活動詳細的技術作業文件所量手冊(辰次A)質量體系程序程序文件(E

次BD標準崗作程序，記錄表格，很告節(E

次C)實驗室質量管理體系的建立衛生部臨床檢驗中心National

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Clinical

Laboratories●SOP

:

形式，缺乏可操作性●記錄：檢查型。多而雜。●質控：形式或沒有●分析：缺乏。衛生部臨床檢驗中心National

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Clinical

Laboratories存在問題實驗室質量管理的內涵●寫你所應做的●做你所寫的●記錄你已做的●分析你已做的衛生部臨床檢驗中心NationalCenterForClinicalLaboratories把解上作商單的事做野就是不簡單把每一件半凡的事做好就是不平凡A#A

序汪中求若細節Derailis

thekey

of

succerr決定成敗新華出版社●看得見的●看不見的衛生部臨床檢驗中心National

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Clinical

Laboratories衛生部臨床檢驗中心National

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Clinical

Laboratorien衛生部臨床檢驗中心National

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Clinical

Laboratorien●思維習慣與行為習慣●羅馬不是一天建成的(Romewas

not

built

ina

day)●

好習慣是生產力●習慣即命運衛生部臨床檢驗中心National

Center

For

Clinical

Laboratories質量體系文件的三大特性●法規性、唯一性和適用性?！穹ㄒ幮裕菏侵肝募坏┲贫ㄍ瓿刹⑴鷾蕦嵤?，就必須認真

執行，按照相應的文件去完成日常檢驗工作，也就是前面所說的做你所寫的。并且文件的修改不能隨意，只能按規

定的程序進行。●唯一性：則是指(1)一個實驗室只能有一個質量體系文件

系統；(2)一項檢驗活動只能有唯一的操作程序；(3)一項規定只能有唯一的理解，不產生歧義；(4)只能使

用文件的有效版本，無效版本在實驗室的任何地方都不能

使用?！襁m用性：是指質量體系文件無統一格式；無標準文本；怎

么做怎么寫，切合實際，具有可操作性，不拘一格。所有

文件的規定均應保證在臨床實際檢測工作中能完全做到。

當發現文件有不適合情況時，則應立即按規定程序對文件進行修改。

National

Center

For

Cliien心nicalLaborat部臨床檢驗SOP

等于試劑盒說明書嗎?衛生部臨床檢驗中心NationalCenterForClinicalLaboratoriesXXX單位XXX實驗室XXX標準操作程序編號：啟用日期：版本：第

頁

共

頁編寫人審核人批準人一目的：二適用范圍：三職責或責任人：四(方法原理)五

(

檢測設備和試劑)六(所需的環境條件)七操作步驟：1.2.3.五、本操作程序變動程序：六、相關的文件七、相關的記錄表格和報告怎樣編寫SOP?National

Center

ForTC生lin部iclao驗ratri心en●

誰來做(Who):

責任人●

做什么(

What):適用范圍●

何時

(When):

適用范圍●

何地

(Where):

適用范圍●

為什么做

(Why):

目的●

如何做

(How):

操作步驟SOP(5W

和1H)衛生部臨床檢驗中心National

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Clinical

Laboratories聚合酶鏈式反應(PCR)可對特定核苷酸片斷進行指數級的擴增，而實時熒光定量PCR技術，是指在PCR

反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個

PCR

進程，最

后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在實時熒光定量

PCR反應中，引入了一種

熒光化學物質，熒光物質有兩種：熒光探針和熒光染料。我們目前是使用TaqMan熒光探針的

檢測原理：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核

苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的

熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq

酶的5'-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報

告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA

鏈，就有一個熒光分子形成，熒光信號強度也等比例增加【圖1】0這樣就可以通過熒光強度

變化監測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。Ttritten

b制人Date日期：20100120Effective

Date生效日期：Distribution

Scope發放范國：Gene

Lab臨床基固擴培實驗室Reviewed

by審核者：Approved

b批準人Dooment

Anmually

Raviewing文件年度審核Reviewed

by審核者：Reviemed

b審核者：Ravieved

b審核者：Date日期Date日期Data日期Reviered

by審核者：Reviewed

by審核者：Feviewed

by審核者：Date日期Date日期Date日期tPotynotsution2.stranddmpbusmana40Assay項目名稱English英文HBVDNAChinese中文乙型肝炎病毒核酸Me

thod方法聚合酶鏈反應Basis

for

method方法依據衛生部《全國臨床檢驗操作規程》第3版(2006年)第七篇第六章第一節二乙型肝炎病毒(HBV)DNAPCR(ABI7300)檢測標準操作程序1.INFORMATION

FOR

TFSI檢測信息衛生部臨床檢驗中心Clinical

Laboratorien2.AHALYTICALPRINCIPIE檢

測

原

理圖14.Polymongohon

complotedR·Rupoder

9-Ouenchm熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意

位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。

每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數被稱為

CT

值(thresholdvalue)

。CT

值與起始模板的關系研究表明，每個模板的

CT

值與該模板的起始拷貝數的對

數存在線性關系，起始拷貝數越多，CT

值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準

曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代表

Ct值。因此，只要獲得未知樣品的

Ct一般而言，熒光擴增曲線擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段、熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷

產物量的變化。而在平臺期，擴增產物已不再呈指數級的增加。

PCR的終產物量與起始模板

量之間沒有線性關系，所以根據最終的PCR

產物量不能計算出起始

DNA

拷貝數。只有在熒

光信號指數擴增階段，

PCR

產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，可以選擇在這

個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量

PCR技術中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和

CT值【圖2】。圖2值基線o3101衛生部臨床檢驗中心rClinicalLaboratorien樣本Cr20循環數無模板對照5

ao值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數【圖三】。Rn+△AnAn-

40045Iypes類型Suggested

types推薦類型血清Preferred

types可接受類型EDTA或枸櫞酸鈉抗凝血漿Volume樣本量0ptimum最佳量1.0

mlMinimum最少量200

ulCollection

Containers收集容器含促凝膠試管或普通試管(不含其它物質)Transport

containers運輸容器帶蓋試管Transport

requirenents運輸要求在室溫條件下運送(可接受冷凍及冷藏樣本)Stability

&Storage

Requirements

穩定性及儲藏要求Room

temperature

室溫8小時Refriger

atedtemperatumre冷藏溫度(2-8T)3

天-20℃2星期-70℃長期Timing

Considerations時間要求無Unacceptable

Specimens.Actions

to

Take樣本拒收及采取措施拒絕重度溶血樣本、肝素抗凝的血漿Compromising

Physical

Characteristies

/

Interfering

Factors影響/干擾因素溶血或脂血標本可能會嚴重影響實驗結果0ther

Considerations其它條件應避免反復凍融標本3.1

Patient

Preparation病人準備事項Component準備事頂Details具體內容Fasting/Special

Diets禁食/特種次食不要求禁食，但由于明顯的脂濁可干擾反應，所以空腹

標本較為理想Patient

Preparation病人的準備事項無Special

Collection

Procedures

樣本采集特殊要求避免溶血，抗凝血標本6小時內分離血漿，不抗凝血標

本2小時內分離血清衛生部臨床檢驗中心ClinicalLaboratorien3.2SpecimenType&Handling樣本類型及處理方法3.SPECDMENREQUIREMENIS樣

本

要

求4.REAGENIS

試

劑Manufacturers

生產廣家艾康生物技術(杭州)有限公司Approval

Number

批準文號國藥準字20060017Outline

of

Product

試劑想要Type類型Starage

and

Stability

諸藏及穩定性Preparetions

準備工作核酸提取液1.8

ml×1-20℃

6個月室溫平衡20minHBV強陽性對照品100

ul×1-20℃

6個月室溫平衡20minHBV臨界陽性對照品100

ul×1-20℃

6個月室溫平衡20min陰性對照品100

ul×1-20℃

6個月室溫平衡20minHBV定量標準品20

ul×1-20℃

6個月室溫平衡20minAttention注意事項：開啟所有試劑盒(包括校準品、標準品)均需注明開啟日期及開啟人(除該試劑盒一次性全部用完)。每個試劑盒都應貼有下列標簽：物質名稱、批號、特殊儲藏說明，開啟人，開

啟日期，開啟后有效期。開啟時應檢查試劑是否存在變色，是否有肉眼可見的細菌生長跡象、

濁度、沉淀反應等，如有則表示該試劑已經變質或超過保質期需要廢棄。5.EQUIPHENI儀器設備Name名稱Storage

and

Stability

儲藏及穩定性Preparetions準備工作HEV

DN陽性

室內質控品-20=℃

6個月室溫平衡20min,使用前需2000rpm離心數秒HBVDNA陰性

對照品-20=C

6個月室溫平衡20min,使用前需2000rpm離心數秒6.2Frequency質控周期每檢測一批次標本均需同時檢測至少一個濃度水平的陽性質控品、陰性對照品、臨界陽也

對照品及只含反應混合液的空白對照。6.3CoefficientofVariation

CV變異系數EQUIPMENT使用的儀器設備Name名稱Specifications型號Calibration

methods校準方式實時熒光PCR儀ABI

7300送校備注：“校準方式”欄填寫送校、自校、檢定、比對等。6.QUALITYCONTRDL

質里控制6.1

ControlsUsed質控品衛生部臨床檢驗中心Clinical

Laboratorien不同濃度的質控品對應的最大允許變異系數詳見下表。質控品濃度范圍1.0-9.0E+03IU/ml最大允許變異系數5.56%7.2Frequency定標周期每一批次標本均需同時檢測4個標準品。7.3

Procedure程序分別在相應的反應管加入4個梯度的標準品(無需進行核酸提取過程),同病人標本一起上

機擴增分析。7.4Correctiveactionforunacceptablecalibration定標失敗處理

應采取以下步驟，但不僅限于此：7.4.1

檢查擴增程序設置是否正確。7.4.2檢查試劑和標準品是否過期，如已過期，則替換。7.4.3檢查標準品反應管中是否含有反應混合液。7.4.4核實儀器的計劃維修是否均按時進行，如否，則執行儀器保養程序。7.4.5重新定標。1.0-9.0E+04IU/1

4.1751.0-9.0E+05IU/r3.3351.0-9.0E+06u/t

2.781.0-9.0E+07Iu/z2.3816.4AnalyticMethod分析方法6.4.1陽性質控品及陰性對照品室溫靜置復融20min后，和樣本同樣檢測。6.4.2將陽性質控品檢測結果取以10為底的對數值輸入LIS的質控系統中，系統自動作圖分析6.4Judgerulesofunacceptablecontrol失控判斷規則詳見SOP-PCR005-G《臨床基因擴增實驗室室內質控標準操作程序》6.5Correctiveactionforunacceptablecontrol失控處理詳見SOP-PCR005-G《臨床基因擴增實驗室室內質控標準操作程序》7.CalibrationProcedure定標7.1Standards標準品Name名稱Type類型Traceability瓶原方式Storage

andStability儲藏及穩定性Preparetion

準備工作HBV

DNA定量

標準品20

ul/管溯源于國家技術監督局批準的GBW(E)090031所提供的乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)血清標準物質-20℃

6個月室溫平衡20min,使

用前振蕩混勻數秒

并2000rpm離心數

秒衛生部臨床檢驗中心Clinical

Laboratorien8.PRDCEDURE操作步驟8.1試劑配制8.1.1進入試劑準備區，開啟冰箱冷凍層取出HBV-DNA檢測試劑盒【圖4】。查看外包裝盒(包括生產批號、有效

期),無誤后拆開試劑盒，取出核酸提取液、反應液及Taq

酶(核對核酸提取液、HBVPCR反應液及Taq酶管上批號與試劑外包裝盒批號是否一致)【圖5】,不一致則不可使用，需

更換新的試劑。室溫平衡20min,完全融化后2000rpm離心備用。8.1.2核酸提取液的分裝a.取0

.

5ml

離心管架置于超凈工作臺內(開機前用紫外線消毒30分鐘),用右手拿起鑷子逐個將離心管放入

離心管架(注意應夾住離心管外壁，

不能碰到管內壁),擺放順序為橫列從左往右擺，豎列為從上往下隔行排，

離心管個數為n(n=樣本數+對照品+質控品)。完成后將鑷子放回原位【圖6】。b.用移液器準確吸取核酸提取液

50ul分裝至0.5ml離心管中(左上角

第一排開始，從左往右依次加入)。因

核酸提取液內含固體沉淀顆粒物，為

使顆粒均勻分布，故每次取樣時都要

用移液器反復吸打3-4次【圖7】。分衛生部臨床檢驗中心Clinical

Laboratorien從左往右擺隔行排列圖6夾住

管

懸

外

部管蓋朝前c.

加完一架后用右手拿鑷子將離心管拿起，左手大拇指和中指夾緊離心管下部，然后用食指將蓋子蓋上，順序為：從右下角第一個開始，從右往左依次蓋上【圖8】。離心管蓋全部蓋完后，通過傳遞窗轉移至標本處理區。8.1.3HBV-DNA反應液的配制每批需設置空白對照、陰性對照、臨界陽性對照(如同時檢測低值陽性質控品，則無需再檢測臨界陽性對照)、陽性質控品、陽

性標準品。所需每批需配制數

n=樣本數+對照品+陽性標準品+質控品，每個測試反應體系配

制如下表a.

每盒HBV-DNA

試劑可檢測32人份，根據每日需檢測標本份數計算出每批所需HBV

FCR反應液和Taq酶用量(例：有111人份需要進行檢測，則有3盒試劑可直接使用10ul

移液器將Taq

酶加入HBV

PCR反應液中，另有111-3*32=15人份試劑需將

HBV

PCR反應液和Taq

酶使用移液器按反應體系比例吸取至1.5ml離心管中配制【圖9】)。b.取出離心后備用的HBV

PCR反應液和Taq

酶，按上述要求配制后用旋渦振蕩器振蕩混勻5-10sec,然后再用離心機2000rpm離心10sec備

用試村HBV

FCR反應液Taq酶用量(ul)35.70.3生部臨床檢驗中心inicalLaboratorien裝完畢后將移液器量程歸位?！緢D10]。e.從操作臺面上拿取

HBV-DNA試劑配制盒(可選用空余的200ul

槍頭盒)至超凈工作臺內，打開配制盒并用記號筆在相應的孔位右旁按順序編號【圖11】0編號規則為：樣本擴增反應管對應的孔位按相應的樣本流水號編寫、陽性質控品反應管對應的孔位編“Q”如有高值則標為H,低值為L),陰性對照品孔位編“-”,臨界陽性對照對應的孔位編“±”,空白對照對應的孔位編“B”,1

號標準品對應的孔位編“S1”,2

號標準品對應的孔位編“S2”,依此類推。d.編號完畢后，用右手拿起鑷子夾起反應管(ABI7300

使用的是八聯-薄壁反應管，鑷子應夾住反應管外壁，不可接到內壁【圖12】)e.

按【圖13】所示方向依次將所有反應管(反應管數=n)

隔列擺放到配For衛生部臨床檢驗中心ClinicalLaboratorien置盒上?！緢D13】8.1.3.7從離心機中取出已混好Taq

酶的PCR反應液，用移液器(量程調

至36ul),

準確吸取反應液并按從上

到下、從左至右的順序依次加至反應

管中，注意：吸頭應深入到反應管底

部，放液時應緩慢，切勿形成氣泡。

【圖14】。8.1.3.8全部加樣完畢后將配制盒通過傳遞窗轉移至樣本處理區。

8.2標本處理8.2.1標本、質控品及對照品的處理8.2.1.1從冰箱冷凍室取出

HBVDNA陽性質控品陰性對照品室溫平衡20min待其完全融化。8.2.1.2核對標本和原始申請單的條形碼和檢驗項目，無誤后依次粘貼上相應的流水號，如質控及對照8.2.1.3從傳遞窗中取出試劑準備區分裝好核酸提取液的離心管架，移至生物安全柜內在管蓋上用記號筆寫上阿拉伯數字1、2、3……,陽性質控管標

隔行排列上“Q”

如有高值則標為H,低值為L),

圖

15陰性對照管標上“-”,臨界陽性對照管標上“±”。離心管蓋上標記的是1,就表示該管要加入流水號為P0001的標本【圖15】。注意：每個離心管的編號方向都應朝向

管口開啟的方向?！緢D16】衛生部臨床檢驗中心Clinical

Laboratories8.2.1.4去除標本管蓋：將標本從前處理取至標本準備區，按排列順序依次去除樣本管上的橡膠塞。具體操作為：在生物安全柜中，左手拿起血清管并固定，右手拇指和中指捏緊橡膠塞，右手食指輕輕頂住橡膠塞頂部凹面，逆時針方向輕輕旋下橡膠塞后廢棄于裝有消毒液的垃圾桶(圖17】注意：手指切勿接觸到血清管口或碰觸到血清，如手套上有血清則需及時跟換新的手套；待所b.

吸樣完畢后，將樣本管放至另一試管架中(切勿不可將樣本放回原試管架位)【圖19]。圖10c.

再用左手按8.2.1.3所述樣本流圖20新位置原位置發力方向固定管體8.2.1.5樣本及對照品的處理：a.左手拿起樣本，用量程為200ul調至50ul

的移液器準確吸取樣本

(注：為保證樣本的均一性和吸樣準

確，每次取樣時需用移液器將樣本吸

打3-5次；吸樣時移液器套筒不可接角觸到樣本管內壁)【圖18】吸打樣本3-5次套筒不可接觸

樣本管內壁圖18衛生部臨床檢驗中心For

Clinical

Laboratories有樣本管蓋都去除完畢后，也需更換新的手套。)e.

加樣完畢后棄槍頭于盛有消毒液的垃圾桶中(注：一個吸頭只能用于

一個樣本的吸樣，禁止使用一個吸頭

重復吸取不同樣本)。同時蓋上離心

管蓋并放回離心管架(放回的位置需

另起一行，切不可放回原位),繼續處理下一個樣本。對照品和質控品同病人樣本一樣處理?！緢D22】f.

待一架離心管全部加樣完成后用

振蕩混勻器充分振蕩混勻10-15秒。g.

左手將混勻后的離心管轉移至恒

溫金屬浴上(注：離心管需對稱的放

置在恒溫金屬浴相匹配的孔槽內),用計時器計時，100℃(誤差不超過±1℃)干浴10min(誤差不超過±30sec)?！緢D23】水號和離心管編號的對應關系拿起相應的離心管，打開離心管蓋(注：單手操作，食指和中指固定離心管，拇指稍向后上方發力打開管蓋，手指切勿碰到離心管口和管蓋內側)【圖20】。d.

管蓋完全打開后，用左手食指、拇指和中指固定離心管，將吸頭中的樣本

全部打入離心管底部，輕輕吸打混勻

3-5次?！緢D21】衛生部臨床檢驗中心Clinical

Laboratorien加熱孔與離心管體積相匹配溫度顯示圖23i.將上述離心管按順序對稱放入低溫高速離心機轉子孔內，擺放離心管時要將離心管開口朝內，蓋上轉子蓋及離心機蓋后，12,000rpm

離心10mino(注：離心時需在轉子孔內放置0.5ml離心管專用適配器X

圖26】。j.待離心結束后，取出離心管并按編號順序依次擺放在離心管架上(參照【

圖15】的排列方式)并4℃冰箱保存備用；若當天不使用，則應保存在-20℃條件下，使用前置室溫平衡

20min,

再以12,000rpm離心10minoh.十分鐘后(前后不超過半分鐘),右手用鑷子夾起橡皮墊從恒溫金屬

浴中拿出離心管【圖25】干浴時用離心管架置于加熱的離心管上，防止離心管蓋因加熱爆開導致標本間的污染【圖24】衛生部臨床檢驗中心Clinical

Laboratorien圖27b.核對取樣的離心管上編號與加樣的反應管編號是否一致，并將上清液全部打入反應液中，切勿打到反應管壁上。【圖28】8.2.2加樣操作(在實驗臺上操作)8.2.2.1用量程為10ul(先將吸樣量調至4ul)的移液器依次將樣品、對照品、質控品提取后的上清液及HBV

標準品各4ul加到對應的反應管中。a.準確吸樣，吸頭浸入上清液的深度≤1mm,注意不要碰到沉淀，移液

器套筒不可碰到離心管蓋和管壁(標

準品應先用移液器吸打3-5次以混

勻)【圖27】d.蓋上離心管蓋并放回離心管架(放回的位置為另一行，不可放回原位)【圖29】核對編號

是否-

致圖28c.

每加一個樣本后將吸頭廢棄于盛有消毒液的垃圾桶中，并更換新的吸

頭處理下一樣本。衛生部臨床檢驗中心Clinical

Laboratorien套筒不可磁

管蓋、管堆吸頭浸入深度≤1mm待加樣

標本已加樣標本對照品、質控品

標準品圖298.2.2.3將反應管連同試劑配置盒通過傳遞窗傳至擴增分析區。8.3擴增分析8.3.1打開擴增儀專用電腦，待電腦完全啟動進入操

作界面后再開啟定量PCR儀主機電源。a.按壓托盤以打開它【圖31】b.

將反應管按順序縱向放置放入反應板架(注：在反應管總數不足96個時，應對稱的將反應管放置在反應板袈上，兩邊放置要求盡可能對稱，可以防止熱蓋下壓時發生傾斜，也可以使各反應管受力和受熱都比較均勻)【圖32】。c.按壓托盤以關閉它。8.2.2.2待全部樣本加樣完畢更換手套，左手用鑷子夾起反應管蓋的一

側的延伸段(不要碰到管蓋),然后

用右手大拇指從左往右依次蓋緊管

蓋(不要碰到其他未蓋的反應管口)

【如圖30]。從前往后從左往右衛生部臨床檢驗中心Clinical

Laboratorien圖30b.

單擊“新建”,軟件自動彈出“Newdocument

wizard”窗口，

A31ay

欄選擇“

StandardCurve(Absolute

Quantitation)”,

Cortane

欄選擇“96-Well

Clear”,

AunMoo欄接

受默認的”Standard7300”

。再

點

擊Browse

選擇反應程序?！緢D34】c.點

擊

Brawse.

進

入

Templatar文件夾，選擇并雙擊預先已經按試劑

說明書編好擴增程序的“ACONHBV.sdt”反應板文件【

圖35】,

回

到“New

document

wizard”窗口，點擊

Firith

進入樣本編輯界面。

【圖35】8.3.2擴增程序編輯a.在電腦桌面上找到ABI7300運行程序，

鼠標左鍵雙擊進入【圖33】衛生部臨床檢驗中心Clinical

LaboratorienAUNHPpostmg白c7區mn10028白

-DeAxpMb輸入保存名稱

選擇保存類型則擴增位置的編號=樣本流水號=樣本提取時的離心管號=反應管載體

的

編

號

=

1

,

依

此

類

推

；②陰性對照為-③臨界陽性對照為+-④質控品為Q(高值為H,低值為L)⑤四個標準品為S1

、S2

、S3

、S4

(

左

鍵雙擊S1彈出WellInspector窗口，

選

中

4

個

標

準

品

并

在Task選項中選e.編輯完成后，單擊

按鈕，彈跳出SaveAs窗口，在Fe

name.欄填

寫該批次標本檢測的唯一名稱(如2009-01-

16第一批樣本檢測名稱就Save酵type

編

輯

為20090116HBV-1),

欄選擇

SDS

Docupentg廣adsl

最后單擊Save

保

存?！緢D37】擇Standard,并在Quantity中填上相對應的標準品數值)⑥空白對照為Bo【圖36】衛生部臨床檢驗中心ClinicalLaboratoriesd.根據儀器上反應管放置的位置在軟件中對應的孔位上編號，編號規則如下：四

國

四質控及對照編號

國

面樣本編號國有目

自ADICON

P0001①樣本流水號是國59t?ro2009-01-16行口4to006目

;及36準號白目目貌日四m自b.

條件設定單

擊

Ampfication

Plot

窗口。①

選擇

6

Manua

Baselne

調節模式，Stat

[oyclo}

選

擇

6

,

End(cyde}

選擇15(也可根據儀器實

際情況，兩者在2-15之間變化);②

閾值設定原則以閾值線剛好超

過正常陰性對照品的最高點并進入

指數擴增期(可手工上下拖動閾值線

)

,設定好后單擊

Anabve

【圖40】。圖40步驟循環數溫度時間1137℃2min2195℃5min34094℃20sec60sec①核對擴增程序是否與試劑說明書完全一致②核對反應體積是否正確；③核對熒光信號采集時間是否與試

劑說明書一致。擴增程序具體設置如下：反應體積為40ul,熒光信號采集時間為“62℃60sec”程序處。e.核對無誤后，單擊

Slat

二開始運行程序，整個程序運行時間約為1小時40分鐘。sDSv1.4Therunwsstoopedbytheuser,圖39

oK8.3.3結果分析a.擴增程序運行結束后，軟件出現提示窗口，單擊OK。

【圖39】衛生部臨床檢驗中心ClinicalLaboratoriesYnstentf.

單

擊

編輯窗口【圖38】:進入擴增程序62℃以上幾項標準均達到要求后，當日實驗有效，可以發放報告。其中任何一項未達到要求，須

查找原因，分析該批結果是否可靠，必要時重新檢測。b.將原始結果打印，按編號對應關系將所有樣本的結果輸入LIS系統，同時該打印件作為原

記錄保存歸檔。9.CAICULATIONS結

果

計

算本項目不涉及此條款。10.Repeat

Criteria

and

Resulting復查標準及結果報告10.1Judgmentoftheresult結果審核a.檢測樣本中1.000E+03IU/ml≤HBVDNA≤1.000E+08IU/ml,測定結果有效，可直接c.單

擊LStandardCurve

選項，要求①

斜率在-3.0~-4.0之間。②

截距>40③

相關系數R2>0.99滿足上述三點說明本次標準曲線符

合要求【圖41】。8.3.4結果分析a.

單

擊

Resutts

選項，再選擇

Plate

選項，則顯示該批次所有樣本檢測的結果(以科學計數法方式顯示)【圖42】①

空白對照及陰性對照無擴增，若

檢測了試劑盒自帶臨界陽性對照，則

其CT值≤35;②

陽性質控品結果在控；③

標準曲線符合要求；0300Syicns?SSo1Wve

T0007UNWr

dracm0Weefootkkunrt

aros

Wns*b口

酒

回

回

國

口

施

警beoYinshrumemYResnkePuY(EpedaYcamp0nemYpopnc1onPatY

p1!4國

2002

102

1Q四

1

f

e

+

0

0

2

四15se+00s1四22+0o四un當國hdt0

100634+0020s0。00日42四3624+002eUhon圖42國四1aei因540e-002四neIU/ml時，定量結果小于試劑的檢測下限，報告為<1.000E+03衛生部臨床檢驗中心ClinicalLaboratories報告。b.樣本檢測結果<1.000E+03

IU/ml。c.檢測樣本

HBVDNA為

Undet

IU/ml時，報告為<1.000E+03

IU/ml。d.

樣本檢測結果>1.000E+08IU/ml時，則應用HBV

DNA陰性血清將樣本進行100-1000倍稀釋后再重新進行檢測，并將結果乘以稀釋倍數后報告結果。e.其他注意事項詳見

S0P-PCR027-G《臨床基因擴增實驗室報告審核標準操作程序》的相關

要求。10.2

Reference

Ranges參考范圍<1.000E+03IU/ml10.3AMR分析測量范圍1.000E+03IU/ml≤HBV

DNA≤1.000E+08IU/ml10.4

Clinic

Reportable

Range臨床可報告范圍1.000E+03IU/ml≤HBV

DNA≤1.000E+11IU/ml10.5RepeatCriteria復查標準詳見

S0P-PCRO27-G《臨床基因擴增實驗室報告審核標準操作程序》和

S0P-LAB014-G《實

驗室檢驗結果復查的標準操作程序》中的相關要求。11.CLNICAL.SIGNIFICANCE臨床意義11.1判斷疾病的嚴重程度和傳染性，HBVDNA是直接反映HBV夏制狀態及傳染性的最佳指標。

11.2PCR結果與血清免疫學結果的綜合評價隨著現代醫學的檢測技術的發展，采用基因

擴增技術(PCR)

檢測對HBV-DNA進行乙肝病毒DNA定性和定量，結合二對半檢測結果，對

于機體乙肝病毒感染狀態尤變異株發生和病人預后的評估更為科學。11.3觀察抗病毒藥物療效，指導藥物用量直接檢測血清中的HBVDNA是監控HBV傳染和

觀察抗病毒藥物療效的最可靠的方法。根據《2000年拉米夫定臨床應用指導意見》中國慢

性乙型肝炎病人治療的目的主要就是降低血清HBV

DNA,誘

導HBeAg血清轉換，使LT

正?；?，改善肝臟組織學病變，改善疾病癥狀、體征，提高生活質量，降低肝硬化和肝癌的發生

率。同時血清的

HBVDNA

滴度的動態變化還可在臨床上對用藥的劑量、用藥時間以及是否需

要聯合用藥等提供參考。11.4獻血員窗口期病毒核酸的篩查及早期診斷

HBsAg在血清中的檢出通常在乙肝病毒感染機體后的2-4月出現，平均為56天左右。而HBVDNA的檢出可以將該所謂“窗口期”提前6-15天，對于早期診斷和提高輸血安全有著重要的意義。11.5預測病情、判斷預后

HBV

DNA的定量檢出對于病情的預測和預后的判斷有著參考意

義。通常HBVDNA持續陽性超過6個月的會轉為慢性肝炎?？?HBe陽性患者血清HBVDNA衛生部臨床檢驗中心ClinicalLaboratories持續陽性常提示肝損嚴重。50%以上抗-HBe陽性慢活肝病人，經平均4.5年發展為肝硬化，常與HBVDNA持續陽性有關。11.6器官移植中的作用肝臟器官移植是目前肝硬化晚期治療的唯一方法，但有約86%以上

既往

HBsAg攜帶者術后HBsAg重新出現。檢測HBVDNA可用于觀察免疫受損患者的HBV

感染

狀況。肝移植后乙肝主要是復發，再感染為次要因素。特別是移植前HBV復制水平高者，復

發和再感染的機率是要更高的。定量檢測HBV

DNA為肝移植術后的跟蹤觀測具有較好的臨床

價值。11.7對阻斷母嬰傳播的監測聯合應用高價免疫球蛋白和乙肝疫苗有效地阻斷母嬰傳播，但

仍有5-10×嬰兒對疫苗呈低反應，熒光PCR

可對此進行監測，分析阻斷失敗的原因。12.LIMITATIONSOFMETHDD方

法

限

制12.1InterferingSubstances干擾物質12.1.1嚴重溶血。12.1.2肝素抗凝。12.

1.3脂濁12.2Sensitivity

and

specificity靈敏度和特異性

檢測下限1.000E+03IU/ml13.SAFETY

安全須知13.1S0P-LAB010-G《實驗室消毒標準操作程序》13.2SU0004-G《檢驗工作人員安全防護制度》13.3SU0006-G《意外事故處理制度》14.References

相關文件14.1

EF3002-G《實時熒光PCR技術》14.2EF0012-G《全國臨床檢驗操作規程-第三版》14.3SOF-PCR005-字母代碼《基因實驗室室內質控標準操作程序》14.4S0P-LAB014-G《實驗室檢驗結果復查的標準操作程序》14.5S0F-PCR027-G《臨床基因擴增實驗室報告審核標準操作程序》15.Records

相關記錄15.1

SOF-PCR011-01-G《PCR實驗室檢驗記錄表》15.2

S0P-PCR201-01-G《核酸提取編號記錄表》衛生部臨床檢驗中心ClinicalLaboratorien實驗記錄表格的設計衛生部臨床檢驗中心NationalCenterForClinicalLaboratories●表格種類繁多●重復記錄●表格無實用性，用于檢查的痕跡很重存在問題衛生部臨床檢驗中心NationalCenterForClinicalLaboratories儀器名稱購買日期儀器編號維護要求維護日期維護內容維護人員校準要求校準日期校

準

內

容操作人簽名日期開機時間運行狀態關機時間內

容記錄者備

注2345678910111213141516171819202122232425262728293031衛生部臨床檢驗中心NationalCenterForClinicalLaboratories儀器使用記錄表儀器名稱：

年

月儀器設備維護和校準記錄表4本

記

錄

保

存

期

5

年本

記

錄

保

存

期

5

年編號測定日

期類別(省或衛生部)專業組上報截

止日期上傳日

期質控測定

人簽名質控上傳

人簽名備注1234567891011121314151617181920日

期試劑區標本處理區擴增檢測區執行人12345678910111213141516171819202122232425262728293031衛工

可pu

四

TT

心NationalCenterForClinical

Laboratories室間質評記錄表年年

月注：消毒時間必須30-60分鐘，消毒結束后必須打

√簽字。紫外消毒車消毒記錄表注：質評結果按衛生部或省臨檢中心的要求需另附本記

錄

保

存

期

5

年本

記

錄

保

存

期

5

年日期度

亡度記錄者篇名備莊11410鋪12023編號日

期拒

收

原

因送檢人

簽

字接收人簽

字備

注1234567891011121314151617181920衛生部臨床檢驗中心NationalCenterForClinical

Laboratorien

記

者

期

A

實驗空環境溫濕度記錄表拒收標本記錄表年

月請選擇1.gt試

2.C件.礦檢向n本

記

錄

保

存

期

5

年記錄表格設計的基本原則●

信息充分●簡單明了融入LIS系統?衛生部臨床檢驗中心NationalCenterForClinicalLaboratories●臨床標本的檢測信息能有機聯系起來實驗前準備試劑在有效期內擴增儀、加樣器和溫度計在校準的有效期內

生物安全柜的濾膜在使用有效期內

消毒溶液在有效期內洗眼器內無菌生理鹽水在有效期內

離心管、帶濾芯吸頭已經過質檢合格操作者：臨床PCR檢驗流程記錄表檢驗日期