銅綠假單胞菌外膜蛋白F與HSV

銅綠假單胞菌外膜蛋白F與HSV-1VP22融合DNA疫苗的構建與表達楊勤;雍熙;李婷婷;余嫻;雷軍【摘要】目的:構建銅綠假單胞菌外膜蛋白F與I型單純皰疹病毒(herpessimplexvirus1,HSV-1)VP22融合表達的DNA疫苗,并研究其在真核細胞中的表達情況.方法:構建重組質粒pVAX1-OprF、pVAX1-VP22、pVAX1-VP22-OprFpVAX1-OprF-VP22.原核表達VP22的碳端蛋白，以電洗脫的方法得到純化蛋白，免疫BALB/c小鼠，制備VP22蛋白的抗血清,West-ernblot鑒定抗體特異性?最后，以脂質體法將重組質粒轉染真核細胞，利用Westernblot檢測其在真核細胞中的表達情況?結果:成功制備了抗VP22的抗血清,重組質粒在真核細胞中得到了表達?結論：銅綠假單胞菌OprF與HSV-1VP22融合表達的重組質粒能夠在真核細胞中表達，這為進一步的動物實驗打下了基礎.％Objective:ToconstructtheDNAvaccinefortheoutermembraneproteinFfromPseudomonasaerufinosaandVP22fromherpessimplexvirus1fusiongene,andtostudyitsexpressineukaryoticcells.Methods:TheeukaryoticexpressionvectorspVAX1-OprF、pVAX1-VP22、pVAX1-VP22-OprFandpVAX1-OprF-VP22wereconstructed.TheVP22carboxy-terminalwasexpressedinprokaryoticcellsandpurifiedbyelectroelution.PolyclonalantibodywasdevelopedbyimmunizingBALB/cmicewithpurifiedrecom-binantprotein.ThespecificityofBALB/cmiceantiserumwasmeasuredbyWesternblot.Therecombinantplasmidsweretransfectedin-toeukaryoticcellsbyLipofectamineTM.TheexpressionsofrecombinanteukaryoticvectorswereinvestigatedbyWesternblot.Results:ThepolyclonalantibodyagainstVP22proteinwassuccessfullyprepared.Therecombinantvectorscouldbeexpressionineukaryoticcells.Conclusion:TheeukaryoticexpressionvectorfortheoutermembraneproteinFfromPseudomonasaerufinosaandVP22fromherpessimplexvirus1fusiongenecanexpressineukaryoticcells,whichmaypavesawayforfurtherstudiesinanimals.【期刊名稱】《川北醫學院學報》年(卷),期】2018(033)003【總頁數】5頁(P338-342)【關鍵詞】銅綠假單胞菌;外膜蛋白F;VP22;DNA疫苗【作者】楊勤;雍熙;李婷婷;余嫻;雷軍【作者單位】川北醫學院附屬醫院感染科,四川南充637000;川北醫學院附屬醫院血管外科,四川南充637000;川北醫學院麻醉學系,四川南充637000;重慶醫科大學附屬第二醫院藥學部,重慶400010;川北醫學院藥學院,四川南充637000【正文語種】中文【中圖分類】R378.991銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa，PA)是臨床常見的多重耐藥菌之一，該菌對抗生素耐藥性呈逐年上升趨勢，臨床可選用的抗生素也越來越有限［1］。因此，研究者們將目光投向了針對該菌外膜蛋白F(OprF)的DNA疫苗。有研究表明OprF同時具有B細胞表位及T細胞表位，能誘導特異性免疫反應。但是，免疫反應太弱限制了對其的進一步研究［2-3］。1型單皰病毒(herpessimplexvirus-1，HSV-1）間層蛋白VP22是一種高效的細胞穿透肽（CPPs）［4］，有研究［5-6］表明與VP22蛋白融合表達后，抗原蛋白能誘導更強的免疫反應，彌補裸露DNA疫苗免疫原性差的缺點。本研究通過構建OprF/VP22融合表達的真核質粒，驗證重組質粒在真核細胞內的表達，為進一步研究重組DNA疫苗的體內免疫反應奠定了基礎。1材料與方法1.1材料銅綠假單胞菌（ATCC27853）及非洲綠猴腎細胞系Vero由本實驗室保存；6~8周齡BALB/c雌性小鼠購自川北醫學院動物實驗中心；pGEX-C45（pGEX-5X-1與編碼VP22蛋白碳端的257-301氨基酸殘基的基因片段的連接）和pcDNA3-VP22（pcDNA3與HSV-1編碼VP22蛋白的UL49基因的連接，酶切位點為EcoRI,）由余嫻教授惠贈［7］;PVAX1真核表達質粒購自贏潤生物公司；BamHI、EcoRI、XhoI、Hind皿購自fermentas公司；QuickT4DNALigase購自CellBiolabs公司；引物P1、P2、P3、P4、P5、P6、抗OprF抗血清（兔源性）以及pVAX1-OprF-VP22和pVAX1-VP22-OprF的具體構建由上海生物工程公司完成；HRP標記的羊抗小鼠/兔IgG、抗P-Actin小鼠單克隆抗體、BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）、DAB顯色試劑盒、苯甲基磺酰胺、內參Actin抗體、WesternBlot試劑盒購自Beyotime公司；質粒提取試劑盒、2xTaqPCRMasterMix購自北京天根公司；蛋白酶K購自BIOBASIC公司；溶菌酶購自Merck公司；TtansIT-LT1Reagent2300購自Mirus公司；DL2,000DNAMarker、DNA片段回收試劑盒購自TaKaRa公司；蛋白預染Marker購自Thermo公司；佐劑購自Sigma公司。1.2方法1.2.1DNA疫苗載體的構建（1）pVAX1-OprF的構建：首先提取銅綠假單胞菌（ATCC27853）的基因組，然后根據引物設計原則和編碼OprF蛋白的基因序列設計引物，上游引物P1:5'-CGCGGATCCAAGATGAAACTGAAGAACAC-3'(下劃線處為BamHI酶切位點)；下游引物P2:5‘-CCGCGAATTCTTACTTGGCTTCAGCTTCT-3'(下劃線處為EcoRI酶切位點)，擴增片段大小1053bp。以銅綠假單胞菌基因組為模板，擴增編碼OprF的基因序列，擴增條件為94°C預變性5min,94°C變性30s,59°C退火30s,72°C延伸1min，共30個循環，72C再延伸5min結束。PCR產物純化回收后，與質粒pVAXI分別經EcoRI和BamHI雙酶切，T4DNA連接酶連接。連接產物轉化感受態E°coliDH5a,經Kana+(50g/mL)抗性篩選陽性克隆，純化回收質粒，雙酶切鑒定，并送測序。(2)pVAX1-VP22的構建：直接用EcoRI單酶切pcDNA3-VP22，獲得編碼VP22蛋白的UL49基因，大小為906bp，然后將其連入真核載體pVAXI,連接產物轉化感受態E.coliDH5a,經Kana+(50g/mL)抗性篩選陽性克隆，純化回收質粒，分別經EcoRI及XhoI單酶切鑒定，并送測序。(3)pVAX1-VP22-OprF的構建：根據引物設計原則和編碼VP22蛋白的基因序列設計引物，上游引物P3:5'-TATAAGCTTATGACCTCTCGCCGCTCCGT-3'(下劃線處為Hind皿酶切位點)；下游引物P4:5'-AATTAGGATCCTAACTCGACGGGCCGTCTG-3'(下劃線處為BamHI酶切位點),擴增片段大小906bp。以pcDNA3-VP22為模板，擴增編碼VP22的基因序列。PCR產物純化回收后，與重組質粒pVAX1-OprF分別經Hind皿和BamHI雙酶切，T4DNA連接酶連接。連接產物轉化感受態E.coliDH5a,經Kana+(50g/mL)抗性篩選陽性克隆,純化回收質粒,雙酶切及測序鑒定,具體操作由上海生物工程公司完成。(4)pVAX1-OprF-VP22的構建：根據引物設計原則和編碼OprF蛋白的基因序列設計引物，上游引物P5:5'-GCCAAGCTTAGCATGAAACTGAAGAACAC-3Y下劃線處為Hind皿酶切位點)；下游引物P6:5'-TCAATGGATCCACTTGGCTTCAGCTTCTA-3'(下劃線處為BamHI酶切位點)，擴增片段大小1053bp。以pVAX1-0prF為模板，擴增編碼OprF的基因序列。PCR產物純化回收后，與重組質粒pVAX1-VP22分別經Hind皿和BamHI雙酶切，T4DNA連接酶連接。連接產物轉化感受態E.coliDH5a,經Kana+(50g/mL)抗性篩選陽性克隆，純化回收質粒，雙酶切及測序鑒定，具體操作由上海生物工程公司完成。1.2.2抗VP22抗血清的制備及鑒定(1)GST-C45融合蛋白的誘導表達：將重組質粒pGEX-C45和空載體pGEX-5X-1(作為對照)，分別轉化E.coliBL21(DB3),涂布于Amp+(100g/mL)抗性的LB平板，37°C過夜培養；然后分別挑取pGEX-C45和pGEX-5X-1的單菌落于3mLAmp+抗性的2YT液體培養基中，37°C、200r/min過夜培養；以1:20的比例接種于100mLAmp+抗性的2YT液體培養基中，37°C、200r/min，培養約3h至OD600達0.5~0.6，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，誘導培養4h;4C、800r/min離心10min，沉淀用400L的PBS(pH7.4)重懸，收集菌體。(2)GST-C45融合蛋白的分離純化：在上述收集到的菌液中加入溶菌酶及蛋白酶抑制劑，冰浴30min后行超聲破碎(300W,10s超聲，10s間隔，30次循環),4°C、12000r/min離心10min，分別收集上清液及沉淀包涵體。然后向收集到的沉淀包涵體中加入濃度為6mol/L的尿素2mL,42°C放置30min，待蛋白溶解后8000r/min離心10min，吸取上清。將兩次收集到的上清混合，以15L分裝上清混合物，并加入等體積的2x裂解上樣buffer,沸水放置10min后行12%SDS電泳，考馬斯亮蘭染色，對照蛋白預染Marker,切取相應大小的蛋白凝膠條帶放入已經處理好的透析袋內，加入適量1xTris甘氨酸電泳緩沖液，兩端用夾子夾緊，4C、100V電泳3h;反轉電壓正負極，4C、100V電泳1min，吸取蛋白溶液，將-20C預冷的5倍體積的丙酮緩慢加入蛋白溶液內，-20C放置30min，4C、12500r/min離心20min，移去上清，待殘余丙酮揮發后用雙蒸水重懸沉淀，得到純化的融合蛋白；用BCA法測定純化后的VP22蛋白，濃度為320g/mL，將其稀釋至200g/ml，凍存于-70°C冰箱備用。⑶抗VP22抗血清的制備：隨機抽取10只BALB/c雌性小鼠，其中5只作為實驗組，5只作為對照組。實驗組首次免疫取100g純化的融合蛋白與等體積弗氏完全佐劑乳化，然后腹部皮下多點免疫小鼠，初次免疫后的第2、4、6周取50g純化的融合蛋白與弗氏不完全佐劑乳化加強免疫。對照組以生理鹽水代替純化后的融合蛋白免疫小鼠，其余條件不變。第4次免疫后7天眼內眥取血。靜止離心后分離血清收集抗體。將實驗組收集到的血清命名為陽性血清，對照組收集到的血清命名為陰性血清。（4）Westernblot檢測抗VP22抗血清：首先將收集到的陽性血清與純化后的GST-C45融合蛋白行Westernblot檢測。以脂質體法將pcDNA3-VP22轉染Vero細胞，RIPA裂解液提取總蛋白，用陽性抗血清作為一抗，進行Westernblot檢測；同時取陰性血清為一抗作為對照。1.2.3Westernblot檢測重組質粒在真核細胞內的表達將實驗組分為pVAXI-VP22、pVAX1-OprF、pVAX1-VP22-OprF、pVAX1-OprF-VP22，以脂質體法將分別將其轉染Vero細胞。轉染pVAX1-VP22時用抗VP22抗血清作為一抗，同時轉染pVAXI作為對照；轉染pVAX1-OprF、pVAX1-VP22-OprF、pVAXI-OprF-VP22時以抗OprF抗血清作為一抗，同時轉染pVAXI作為對照。待培養瓶內Vero細胞長至60-70時，分別取5g重組質粒pVAX1-OprF、pVAXI-VP22、pVAX1-VP22-OprF、pVAX1-OprF-VP22與15LTtansIT-LT1Reagent2300加入500L無血清無雙抗細胞培養液，混勻后室溫放置20min，然后將形成的DNA脂質體復合物逐滴加入培養瓶內；同時轉染pVAX1作為參照。轉染后培養72h，用RIPA裂解液提取細胞蛋白，10%SDS電泳分離蛋白，將蛋白轉移至PVDF膜上，Western封閉液1h，一抗4C搖床過夜孵育，二抗室溫孵育1h,DAB顯色。2結果2.1重組質粒的構建重組質粒pVAX1-0prF經EcoRI和BamHI雙酶切后得到大小1053bp的目的基因條帶（圖1A）,DNA序列測定證實該重組真核表達質粒構建成功。重組真核表達質粒pVAX1-VP22經EcoRI酶切后得到大小為906bp的片段（圖1B），由于目的片段可以以正向或反向連入載體，依據載體及目的片段的酶切位點特性，選擇酶切位點XhoI作進一步檢測。正向連接產物經XhoI酶切后可得到大小為75bp和39bp的條帶，電泳時由于分子量太小而不可見；反向連接產物經XhoI酶切后會出現大小為846bp的條帶。實驗中以XhoI單酶切重組質粒pVAX1-VP22時并未觀察到反向連接時會出現的846bp條帶（圖1C），說明VP22基因片段正向連入了載體pVAXI。DNA序列測定證實該重組真核表達質粒構建成功。2.2抗VP22抗血清的制備及鑒定2.2.1融合蛋白的誘導表達及分離純化將空載體pGEX-5X-1和重組質粒pGEX-C45分別轉化E.coliBL21（DE3）表達菌，IPTG誘導，經12%SDS分析表明，與空載體組相比，pGEX-C45額外表達了分子量大小約為30kD的蛋白條帶，大小與預期一致（圖2A）。將重組質粒的原核表達產物行12%SDS電泳，切取相應大小的蛋白凝膠條帶，電洗脫得到純化的GST-C45融合蛋白。經12%SDS-PAGE電泳后可得到單一且位置正確的條帶（圖2B）。BCA法測得純化的GST-C45融合蛋白濃度為320pg/mL,將其稀釋至200g/mL，用于免疫BALB/c小鼠制備抗VP22抗血清。2.2.2抗VP22抗血清的特異性鑒定將純化后的GST-C45融合蛋白經10%SDS-PAGE電泳，轉至PVDF膜，以抗VP22抗血清為一抗，進行Westernblot檢測，在分子量約30kD處可見一特異性條帶，與預期一致，表明制備的抗VP22抗血清可特異性識別純化后的GST-C45融合蛋白（圖3A）。為了進一步驗證抗VP22抗血清的特異性，通過轉染真核重組質粒pcDNA3-VP22，以抗VP22抗血清（陽性血清）為一抗，進行Westemblot檢測，在分子質量約30kD處可見一特異性條帶；以陰性血清作為一抗時則無特異性條帶產生（圖3B）。通過以上實驗證明：制備的抗VP22抗血清可特異性識別VP22蛋白，該抗血清可用于后續實驗中檢測重組真核質粒在細胞內的表達。2.3Westernblot檢測重組質粒的體外表達Westernblot結果顯示，將重組質粒pVAX1-VP22、pVAX1-OprF、pVAX1-OprF-VP22、pVAX1-VP22-OprF分別轉染真核細胞，在相對分子量35kD處可見VP22蛋白的特異性條帶，在相對分子量37kD處可見OprF蛋白的特異性條帶，以及在相對分子量70kD處可見VP22-OprF和OprF-VP22融合表達的特異性蛋白條帶，而對照組無特異性條帶產生（圖4）。3討論OprF是銅綠假單胞菌外模上的主要非特異性通道蛋白，在遺傳上具有高度保守性，免疫原性相對較強，是極具潛力的疫苗候選分子［8］。已有研究表明在人體試驗和動物模型中，OprF可誘導特異性免疫反應，但免疫反應太弱而無法預防細菌感染的發生。Price等［9］將OprF基因克隆至真核表達質粒Pvr1020，成功構建了Pvr1020/OprFDNA疫苗。在銅綠假單胞菌導致的小鼠慢性肺部感染的模型中，該重組質粒可誘導產生特異性抗體，但是與空載體組相比保護力并無明顯差異。研究者們采取許多辦法以期增強OprF的免疫原性，如Westritschnig等［10］制備了銅綠假單胞菌OprF及OprI融合表達的DNA疫苗，免疫原性雖有所提高，但是免疫預防的效果仍有待提升。目前尚無防治銅綠假單胞菌感染的疫苗問世［11］。在DNA疫苗的研究領域，細胞穿透肽VP22顯示出了巨大的應用潛力。VP22蛋白可將與融合的編碼特異性抗原的基因片段以高效跨膜的方式轉運至周圍的抗原提呈細胞，增強抗原的表達，誘導更強的免疫反應［12］。Kim等［13］構建了人乳頭瘤病毒E7基因與編碼HSV-1VP22蛋白UL49基因融合表達的重組真核質粒，將其免疫小鼠后發現，與只編碼E7基因的重組質粒相比，融合表達后的DNA疫苗可引起更明顯的T淋巴細胞毒性反應，說明VP22顯著增強了此DNA疫苗的免疫原性。盡管已有研究表明VP22羧基端是其發揮細胞間轉運功能的重要結構域［4,14］，但是為了確保實驗的嚴謹性，排除蛋白質空間結構差異可能對疫苗免疫效果造成的影響，實驗中我們同時設計了pVAX1-OprF-VP22與pVAX1-VP22-OprF兩種重組DNA疫苗作為研究對象。而pVAX1-OprF與pVAX1-VP22的成功構建，為整個實驗的順利進行奠定了基礎，在后續實驗中起到了很好的對照作用。另外，本研究利用原核表達載體PGEX-C45，誘導表達VP22碳端第257~301氨基酸殘基，獲得重組蛋白GST-C45抗原標準品，制備抗VP22抗血清，經Westernblot證實該多抗血清可與VP22蛋白發生特異性結合。本研究將pVAX1-VP22、pVAX1-OprF、pVAX1-OprF-VP22、pVAX1-VP22-OprF依次轉染真核細胞，同時設置空載體pVAX1作為對照組。通過Westernblot觀察到重組質粒在細胞內都得到了表達。pVAX1-VP22表達了相對分子量約35kD的蛋白。pVAX1-OprF表達了相對分子量約37kD的蛋白。而pVAX1-OprF-VP22和pVAX1-VP22-OprF都表達了相對分子量約70kD的蛋白，與預期一致，推測此蛋白即為OprF與VP22融合表達的結果。這些結果均說明無論是VP22和OprF的單獨基因片段，還是二者的融合質粒，都能在真核細胞中得到表達。但是pVAX1-OprF-VP22與pVAX1-VP22-OprF是否能如預期一樣較pVAX1-0prF誘導更強的免疫反應，以及誰才是最優的疫苗分子，有待進一步的研究。參考文獻汪復，朱德妹,胡付品，等.2012年中國CHINET細菌耐藥性監測J].中國感染與化療雜志,2013,13(5):321-330.WorgallS,KrauseA,RivaraM,etal.ProtectionagainstP.aeruginosawithanadenovirusvectorcontaininganOprFepitopeinthecapsid[J].JClinInvest,2005,115(5):1281-1289.vonSpechtBU,GabelsbergerJ,KnappB,etal.ImmunogenicefficacyofdifferentlyproducedrecombinantvaccinescandidatesagainstPseudomonasaeruginosainfections[J].JBiotechnol,2000,83(1-2):3-12.ElliottG,O'HareP.Intercellulartraffickingandproteindeliverybyaherpesvirusstructuralprotein[J].Cell,1997,88(2):223-233.KimTW,HungCF,KimJW,etal.VaccinationwithaDNAvaccineencodingherpessimplexvirustype1VP22linkedtoantigengenerationslong-termantigen-specificCD8-positivememoryTcellsandprotectiveimmunity[J].HumGeneTher,2004,15(2):167-177.YuX,SiaoS,JiangY,etal.ADNAvaccineencodingtheFMDVcapsidprecursorpolypeptideP1andtheenhancingeffectofbovineherpesvirus1VP22proteinasmolecularadjuvant[J].ActaVirol,2012,56(2):111-117.YuX,LiuLD,WuLQ,etal.Herpessimplexvirustype1tegumentproteinVP22iscapableofmodulatingthetranscriptionofviralTKandgCgenesviainteractionwithviralICP0[J].Biochimie,2010,92(8):1024-1030.StanislavskyES,LamJS.Pseudomonasaeruginosaantigensaspotentialvaccines[J].FEMSMicrobiolRev,1997,21(3):243-277.PriceBM,GallowayDR,BakerNR,etal.ProtectionagainstPseudomonasaeruginosachroniclunginfe