2021年《化妝品微生物標準檢驗方法》

一、（2021.03.07Principle1范圍本規范規定了化妝品微生學檢驗總則。本規范適用于化妝品樣品采集、保存、供檢樣品制備。2儀和設備天。高滅菌器。振器。三瓶。玻珠。玻棒。刻吸管。研。均器。2.10恒水浴箱。2.11采用具：不銹鋼勺，剪刀，開罐器等。3培基和試生鹽水成分：氯化鈉蒸餾水加至mL溶解后，分裝到加玻璃珠三角瓶內，每瓶，103.43kPa(15lb)20min高滅菌。SCDLP液培養基成分：酪白胨大豆蛋白胨氯化鈉5g磷酸氫二鉀葡萄糖卵磷脂1g吐溫7g蒸餾水制法：先將卵磷脂在少量餾水中加溫溶解后，再與其它成分混合，加熱溶解，調pH為7.3分，高壓滅菌。注意振蕩，使沉于底層的吐溫80充分混合，冷卻至25左使用。注：如無酪蛋白胨和大豆白胨，也可用多胨代替。滅液體石。

*陽光明*編3.4滅吐溫。4樣的采集注意事項

所采集的樣，應具有代表性，一般視每批化妝品數量大，隨機抽取相應數量的包裝位。檢驗時，應分別從兩個包裝單位以上的樣品中共取10mL包裝量小的品，采樣量應適量增加，其總量應大于16g。供檢驗樣品應嚴格保持原有的包裝狀態，進口產品應為售包裝。容器不應有破裂，檢驗前不得打開，防止樣品被污染。接到樣品后應立即登記，編寫檢驗序號，并按檢驗要求快檢驗。如不能及時檢驗，品應放在室溫陰涼干燥處，不要冷藏或冷凍。若只有一份品而同時需做多種分析，如微生物、毒理、學等，應先做微生物檢驗，將剩余樣品做其它分析。在檢驗過程，從打開包裝到全部檢驗操作結束，均須防微生物的再污染和擴散，所采樣用具、器皿及材料均應事先滅菌，全部操作應在無菌室內進，或在相應條件下，按無菌操作規定進行。5供樣品的備液樣品5.1.1溶性的液體樣品，量取10mL到滅生理鹽水中混勻后，制成1:10檢。5.1.2油液體樣品，取樣品10mL，加菌液體石蠟混勻，再加10mL滅菌的吐溫，在℃～44℃水浴振蕩混合10min加入滅菌的生理鹽水在40℃44水浴中預溫)，在40～44水浴中乳化，制成的懸。膏霜、乳半固體狀樣品5.2.1水性的樣品，稱取10g加到裝有玻璃珠及滅菌生理鹽水的三角瓶中，充分振混勻，靜置。取其上清液作為的檢液。5.2.2水性樣品，稱取10g放到滅菌的研缽中，加10mL滅液體石蠟，研磨成粘稠狀，加入10mL滅吐溫，磨待溶解后，加滅生理鹽水，在40～44水中充分混合，制成檢液。固樣，稱取10g加滅生鹽水中，充分振蕩混勻，使其分散混懸，靜后，取上清液作為1:10的液。如有均質器，上述水溶性、霜、粉劑等，可稱10g樣加滅菌生理鹽水，均質～2min疏水性膏、霜及眉筆、口紅等，稱10g樣，加滅液體石蠟滅吐80滅生理鹽水，均質～5min二、菌落總數Count1范*陽光明*編

*陽光明*編本規范規定了化妝品中菌總數的檢驗方法。本規范適用于化妝品菌落數的測定。2定本規范采用下列定義菌落總數(aerobicbacterialcount)指化妝品檢樣經過處理，在一定條件下培養后(如養基成分、培養度、培養時間、pH值需氧性質等，1g(1mL)中所含菌落的總數。得結果只包括一群本方法規定的條件下生的嗜中溫的需氧性菌落總數。測定菌落總數便于判明樣被細菌污染的程度，是對樣品進行衛生學總評價的綜合依據。3儀和設備三瓶。量。或精密pH試。高滅茵器試。平：徑9cm刻吸管：、2mL1mL酒燈。恒培養箱。3.10放鏡。4培基和試劑生鹽水見總則中。卵脂、溫80營養瓊脂培養基4.2.1成：蛋白胨牛肉膏氯化鈉瓊脂卵磷脂

3g5g15g1g吐溫7g蒸餾水4.2.2制：先將卵磷脂加到少量蒸水中，加熱溶解，加入吐溫80，其他成分(瓊脂外加到其余的蒸餾水中，溶解加入已溶解的卵磷脂、吐溫80，勻調為7.1～加入瓊脂，103.43kPa(15lb)20min高滅菌，存于冷暗處備用。0.5%化苯氮terazoliumchloride,TTC)成分：TTC蒸餾水100mL溶解后過濾，高壓滅菌，裝于棕色試瓶，置4℃箱用。5操步驟用菌吸管取1:10稀的檢液2mL別注入到兩個滅菌平*陽光明*編

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皿內，每皿1mL另注到滅生理鹽水試管中(注意勿使吸管接觸液面更換一支吸管，并充分混勻，制成1:100檢液。吸取2mL分別注入到兩個滅菌平皿內，每皿1mL。樣含菌量高，還可再稀釋成1:1000，…等，每種稀釋度應換1支吸管。將化冷至45℃℃卵脂溫營養脂培養基傾注到平皿內，每皿約15mL即轉動平皿，使樣品與培養基充分混合均勻，待瓊脂凝固后翻轉平皿，置℃養內養。另取一個不加樣品的滅菌平皿，加入約15mL卵脂吐溫營瓊脂培養基，待瓊脂凝固，翻轉平皿，置37培養箱內培養48h為白對照。為便于區別妝品中的顆粒與菌落，可在每100mL卵脂吐溫80營瓊脂中加入1mL0.5%溶液，如有細存在，培養后菌落呈紅色，而化妝品的粒顏色無變化。6菌計數方先用肉眼觀察，點數菌落，然后再用放大510倍放大鏡檢查，以防遺漏。記下各皿的菌落數后，求出同一稀釋度各平皿生長的平均菌落數。若平中有連成片狀的菌落或花點樣菌落蔓延生長時，該平皿不宜計數若片狀菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落數分布又很均，則可將此半個平皿菌落計數后乘以，以代表全皿落數。7菌計數及告方法首選平均菌落數在30個之間的平皿，作為菌落總數測定的范圍。當只有一個釋度的平均菌落數符合此范圍時，即以該平皿菌落數乘其稀釋倍見表例。若兩稀釋度，其平均菌落數均在30個間，則求出兩菌落總數之比值來決，若其比值小于或等于，報其平均數，若大于2報告其中稀度較低的平皿的菌落(表例2及例。若有釋度的平均菌落數均大于300個，則應按稀釋最高的平均菌落數乘以稀釋倍報告(表1中。若有稀釋的平均菌落數均小于個則按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數告(表例。若有釋度的平均菌落數均不在30個間，其中一個稀釋度大于個，相鄰的另一稀釋度小于30時，則以接近30或300平均菌落數乘以稀釋倍數報之(表1中6)。若有稀釋度均無菌生長，報告數為每g或mL小10CFU菌計數的告，菌落數在10以時，按實有數值報告之，大于100時采二位有效數字，在二位有效數字后面的數值應以四舍五入法計算。為了縮數字后面零的個數，可用10的數來表示表1報方欄)。報告菌落數為“不計，應注明樣*陽光明*編

*陽光明*編品的稀釋度。

表落計結果及報告方式例次

不同稀釋度平均菌落數

兩稀釋度

菌落總數

報告方式1

10-110-210-3136516420

菌數之比

CFU/mL或CFU/mL或CFU/gCFU/g1640016000或1.610423

2760295461.62890271602.2

3800038000或1042710027000或2.71044567

不可計465051327115不可計30512000

513000510000或5.1105270270或2.71023050031000或3.1104＜１10＜10＊CFU菌形成位。三、糞大腸菌群1范本規范規定了化妝品中糞腸菌群的檢驗方法。本規范適用于化妝品中糞腸菌群的檢驗。

定義本規范采用下列定義糞大腸菌群(coliforms)一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌，在44.5℃養24h發酵乳糖酸并產氣。該菌來自人和溫血動物糞，是重要的衛生指示菌。3儀恒水浴箱隔水式恒溫箱：44℃±0.5溫計。顯鏡。載片。接環。電。三瓶。試。小管。3.10pH或試。3.11高滅茵器。3.12刻吸管：10mL2mL。3.13平。4培基和試雙乳糖膽鹽培養基成分：白胨豬膽鹽乳糖

40g10g10g溴酚水溶液*陽光明*編

*陽光明*編蒸餾水

制法：將蛋白胨、膽鹽及糖溶解于蒸餾水中，調pH7.4加入溴酚紫水溶液5mL混，分裝試(支試管中加一個小倒管)68.95kPa(10滅。伊美蘭EMB)脂成分：白胨乳糖磷酸氫二鉀瓊脂

10g10g2g20g伊紅水溶液20mL美水液蒸餾水

制法：先將瓊脂加到蒸水中，加熱溶，然后加入磷酸氫二、蛋，混，之解。以水補足。正為7.2，裝于三角瓶內，103.43kPa(15lb)15min高壓滅菌備用。臨用時加入乳糖并加熱融瓊脂。冷至60左無菌操作加入滅菌的紅美藍溶液，搖勻。傾注平皿備用。蛋胨水(靛基質試驗用)成分：白胨(胰白)20g氯化鈉蒸餾水

5g制法：將上述成分加熱融，調pH值7.0～7.2分裝小試管，高滅菌。靛質試劑柯凡克試劑：將5g對甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊中然緩慢加入濃鹽酸試驗方法：接種細菌于蛋胨水中，于℃養。沿壁加柯凡克試劑0.30.5mL輕搖試管。陽性者于試劑層顯玫瑰紅色。注：蛋白胨應含有豐富的氨酸，每批蛋白胨買來后，應先用已知菌種鑒定后方可使用。革氏染色：4.5.1染制備4.5.1.1結紫染色：結晶紫95%醇

1g草酸銨水溶液80mL將結晶紫溶于乙醇中，然與草酸銨溶液混合。4.5.1.2革氏碘液碘碘化鉀

1g2g*陽光明*編

*陽光明*編蒸餾水加至

300mL

將碘與碘化鉀先進行混合加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至。4.5.1.3脫液：95%醇4.5.1.4復液：沙黃復染液：沙黃95%醇蒸餾水

將沙黃溶解于乙醇中，然用蒸餾水稀釋。稀碳酸復紅液：稱取堿性紅10g研細，加乙醇，放置過夜，濾紙過濾。取該液10mL加5%碳酸水溶液混，為石碳酸復紅液。再取此液10mL加90mL即為稀石碳酸復紅液。4.5.2染法4.5.2.1將涂片在火上固定，滴加結晶紫染色液，染，洗。4.5.2.2滴革蘭氏液，作用1min水。4.5.2.3滴乙脫色，約30s或將乙醇滴滿整個涂片，立傾去，再用乙醇滴滿整個片，脫色10s水洗。4.5.2.4滴復染液復染，水洗，待干，鏡檢。4.5.3染結果革蘭氏陽性菌呈紫色，革氏陰性菌呈紅色。注：如用1:10釋石碳酸復紅染色液作復，復染時間僅需10s。5操步驟取10mL1:10稀的檢液，加到10mL倍濃的乳糖膽鹽培養基中，置℃±0.5℃培箱中培養24h48h如產也產，則報告為糞大腸菌群陰性如產酸產氣劃線接種到伊紅美藍瓊脂平板上，置℃養18h24h同取該培養2滴接種到蛋白胨水中，置44±0.5℃養。經培養后，在上述平板上察有無典型菌落生長。糞大腸菌群在伊紅美藍瓊脂培養基上的型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常具有金光澤。也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紫色，中心深的菌落，亦常為糞大腸菌群，應注意挑選。挑上述可菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢。蛋白胨水養液中，加入靛基質試劑約0.5mL，察靛基質反應。陽性者液面呈玫瑰色；陰性反應液面呈試劑本色。6檢結果報根據發酵乳糖產酸產氣，板上有典型菌落，并經證實為革蘭氏陰性短桿菌，靛基質試陽性，則可報告被檢樣品中檢出糞大腸*陽光明*編

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菌群。四、綠膿桿菌Aeruginosa1范本規范規定了化妝品中綠桿菌的檢驗方法。本規范適用于化妝品中綠桿菌的檢驗。

定義本規范采用下列定義。綠膿桿菌于假單胞菌屬，為革氏陰性桿菌，氧化酶陽性，能生綠膿菌素。此外還能液化明膠，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在42條件下能生長。該菌對人有致病力，可使處化膿，引起敗血癥等。3儀恒培養箱37℃℃三瓶。試。平。刻吸管：、、。顯鏡。載片。接針、接環。電。3.10高滅茵器。4培基和試SCDLP液培養基見總則中。十烷基三基溴化銨培養基成分：肉膏蛋白胨10g氯化鈉十六烷基三甲基溴化銨瓊脂20g蒸餾水制法：除瓊脂外，將上述分混合加熱溶解，調為7.47.6加瓊脂，68.95kPa(10滅后，制成平板用。乙胺培養成分：酰胺10g氯化鈉無水磷酸氫二鉀無水磷酸二氫鉀硫酸鎂酚紅（溶）*陽光明*編

*陽光明*編瓊脂20g蒸餾水

制法：除瓊脂和酚紅外，其它成分加到蒸餾水中，加熱溶解，調pH為7.2加入瓊脂、酚紅，103.43kPa(15lb)20min高壓滅菌后，制成平板備用。綠菌素測用培養基成分：白胨氯化鎂1.4g硫酸鉀10g瓊脂甘油化學純)10g蒸餾水制法：將蛋白胨、氯化鎂硫酸鉀加到蒸餾水中，加溫使其溶解，調至7.4，入瓊脂和甘油，加熱解，分裝于試管內，68.95kPa(10壓滅菌后，制成斜面備用。明培養基成分：肉膏3g蛋白胨明膠蒸餾水制法：取各成分加到蒸餾中浸泡20min時攪拌加溫使之溶解，調pH至分裝于試管內，經68.95kPa(10lb)20min滅菌后，直立制成高層備用。硝鹽蛋白水培養基成分：白胨酵母浸膏硝酸鉀亞硝酸鈉0.5g蒸餾水制法：將蛋白胨和酵母浸加到蒸餾水中，加熱使之溶解，調為，過濾后補足液量，加入硝酸鉀和亞硝酸鈉，溶混勻，分裝到加有小倒管的管中，lb)20min菌后備用。普瓊脂斜培養基成分：白胨牛肉膏3g氯化鈉瓊脂蒸餾水制法：除瓊脂外，將其余分溶解于蒸餾水中，調pH為～7.4加瓊脂，加熱溶，分裝試管，103.43kPa(15lb)20min高滅菌后，制成斜面備用。*陽光明*編

5操步驟

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增培：取1:10樣稀釋液加液培養基中，置37培～24h如有綠膿桿菌生長，培養液表面多有一層薄菌膜，培養液呈黃綠色或藍綠色。分離培養：培養液的薄膜處挑取培養物，劃線接種在十烷基三甲基溴化銨瓊脂平板，置℃養～。膿桿菌在此培養基上，其菌落扁無定型，向周邊擴散或略有蔓延，表面濕潤，菌落呈灰白色，菌周圍培養基常擴散有水溶性色素，此培養基選擇性強，大腸艾希菌不能生長，革蘭氏陽性菌生長較差。在缺乏十六烷基三甲基溴銨培養基時也可用乙酰胺培養基進行分離，將菌液劃線接種于板上，放℃24h，膿桿菌在此培養基上生長良好，菌落平，邊緣不整，菌落周圍培養基略帶粉紅色，其它菌不生長。染色鏡檢：取可疑的菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢為蘭氏陰性者應進行氧化酶試。氧化酶試驗取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內用無菌玻璃棒挑取綠膿桿菌疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%甲對苯二試液，在～30s之，出現粉紅色或紫紅色時，為氧化試驗陽性；若培養物不變色，為氧化酶試驗陰性。綠菌素試：取可疑菌落2～3個分別接種在綠膿菌素測定培養基上，置℃養24h加入氯仿～5mL充振蕩使培養物中的綠膿菌素溶解于仿液內，待氯仿提取液呈藍色時，用吸管將氯仿移到另一試管中加入1mol/L的酸1mL左右，振蕩后，靜置片刻。如上層鹽液內出現粉紅色到紫紅色時為陽性，表示被檢物中有綠膿菌素存。硝酸鹽還原氣試驗：挑取可疑的綠膿桿菌純培養物，接在硝酸鹽蛋白胨水培養基中置37℃養，觀察結果。凡在硝酸鹽蛋白胨水培養基內的小管中有氣體者，即為陽性，表明該菌能還原硝酸鹽，并將亞硝酸分解產生氮氣。明膠液化試，取綠膿桿菌可疑菌落的純培養物，穿刺接在明膠培養基內，置37培養，出放冰箱10min30min如仍呈溶解狀時即為明膠液試驗陽性；如凝固不溶者為陰性。42℃長驗挑可的綠膿桿菌純培養物，接種在普通瓊脂斜面培養基上，放在～℃箱中，培養～，膿桿菌能生長，為陽性，而似的熒光假單胞菌則不能生長。6檢結果報被檢樣品經增菌分離培養，在分離平板上有典型或可疑菌落生長，經證實為革蘭氏陰性菌，氧化酶及綠膿菌素試驗皆為陽性者，即可報告被檢樣品中出綠膿桿菌；如綠膿菌素試驗陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產氣℃試驗三者皆為陽性時，仍可報告被檢樣品中檢出綠膿桿。*陽光明*編

*陽光明*編五、金黃色葡萄球菌Aureus

1范本規范規定了化妝品中金金色葡萄球菌的檢驗方法。本規范適用于化妝品中金色葡萄球菌的檢驗。

定義本規范采用下列定義金黃色葡萄球菌aureus)為革蘭氏陽性球菌，呈萄狀排列，無芽胞，無莢，能分解甘露醇，血漿凝固酶陽性。該菌是葡萄球菌中對人類病力最強的一種，能引起人體局部化膿性病灶，嚴重時可導敗血癥。3儀和設備顯鏡。恒培養箱離機。刻吸管：1mL5mL。試。載片。酒燈。4培基和試SCDLP液培養基見總則中。4.2

Baird氏養基成分：胰白胨牛肉膏酵母浸膏1g丙酮酸鈉甘氨酸12g氯化鋰瓊脂20g蒸餾水7.0±0.2增菌劑的配制：30%黃水除菌過濾的1%碲鉀溶液混，保存于冰箱內。制法：將各成分加到蒸水中，加熱煮沸完全溶解，校正pH分裝每瓶95mL高滅菌。用時加熱溶化瓊脂培養基，每加預至℃卵亞碲酸增菌劑5mL搖勻后制成平板。培養基應致密不透明的。使用前在冰箱貯存不得超過48h血脂培養基成分：營瓊脂100mL脫纖維羊血(兔血10mL*陽光明*編

4.*陽光明*編4.制法：將營養瓊脂加熱融，待冷至℃右菌操作加入脫纖維羊血，搖勻，制成平，置冰箱內備用。甘醇發酵培養基成分：蛋胨氯化鈉甘露醇10g牛肉膏5g麝草藍溶液12mL蒸餾水制法：將白、氯化、牛肉膏加到蒸餾水中，加熱溶解，調pH7.4，入甘露醇和指示劑混勻后分裝試管中，68.95kPa(10lb)20min菌備用。兔人)漿制備取3.8%檸酸鈉溶，高壓滅菌，1加兔人)血4份，勻靜置；～3000離～5min血下，上面血漿。無菌液體石蠟。5操步驟增菌：取1:10稀的品10mL接到SCDLP體培養基中，置37培養箱，培養。分離：自述增菌培養液中，取～接種環，劃線接種在BairdParker平，如無此培養基也劃線接種到血瓊脂平板，置37培養～。血瓊脂平板上菌落呈金黃色，大而突，圓形，不透明，表面光滑，圍有溶血圈。在Baird板上為圓形，光滑，凸起，濕潤直徑為～，色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為混濁帶，在其外層有一透明帶。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠軟度。偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落，但無混濁帶及透明帶挑取單個菌落分純在血瓊脂平板上，置37培養。染色鏡檢：取分純菌落，涂片，進行革蘭氏染色，鏡檢金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽菌，排列成葡萄狀，無芽胞，無夾膜，致病性葡萄球菌，菌體較，直徑約為0.5μm1μm露醇發試驗：取上述分純菌落接種到甘露醇發酵培養中，在培養基液面上加入2mm3mm的菌液體石蠟，置37℃養24h金黃色葡萄球菌應能發酵甘露醇產酸。血凝酶試驗：吸取新血0.5mL放入滅菌試管中，加入待檢菌24h湯培養物0.5mL。勻，放℃溫或恒溫水浴中，每半小時觀察次之如呈現凝塊即為陽性。同時以已知血漿凝固酶陽性和性菌株肉湯培養物及肉湯培養基各0.5mL分別加入滅菌1:4血0.5mL混勻，作為對照。6檢結果報經增菌培養后，在分離平上有典型或可疑菌