第二章蛋白質化學

第二章蛋白質化學導學掌握蛋白質的分子組成與結構熟悉蛋白質的理化；常用分離、純化技術的基本原理。了解蛋白質分子結構與功能的關系；蛋白質的分類以及重要的活性肽。教學內容蛋白質的分子組成蛋白質的分子結構蛋白質的理化性質與分離純化蛋白質的分類一、什么是蛋白質?蛋白質(protein)是由許多氨基酸(aminoacids)通過肽鍵(peptidebond)相連形成的高分子含氮化合物。二、蛋白質的生物學重要性1.蛋白質是生物體重要組成成分分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質；細胞的各個部分都含有蛋白質。含量高：蛋白質是細胞內最豐富的有機分子，占人體干重的45％，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達80％。1）作為生物催化劑（酶）2）代謝調節作用3）免疫保護作用4）物質的轉運和存儲5）運動與支持作用6）參與細胞間信息傳遞2.蛋白質具有重要的生物學功能3.氧化供能蛋白質的分子組成

TheMolecularComponentofProtein第一節組成蛋白質的元素主要有C、H、O、N和S。

有些蛋白質含有少量磷、硒或金屬元素鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬，個別蛋白質還含有碘。各種蛋白質的含氮量很接近，平均為16%。100克樣品中蛋白質的含量(g%)=每克樣品含氮克數×6.25×1001/16%蛋白質元素組成的特點一、氨基酸

——組成蛋白質的基本單位存在自然界中的氨基酸有300余種，但組成人體蛋白質的氨基酸僅有20種，且均屬L-氨基酸（甘氨酸除外）。H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式R氨基酸結構特點：20種編碼氨基酸氨基酸的不同在于R側鏈不同均為L-α-氨基酸（甘氨酸、脯氨酸除外）氨基酸的旋光異構除了甘氨酸以外，其它氨基酸的α-碳原子都是手性碳原子，有D和L構型之分，甘氨酸除外。什么是α-氨基酸連接一個氨基、一個羧基、一個氫原子和一個側鏈基團（R）的碳原子叫作α-碳原子。具有α-碳原子的氨基酸稱為α-氨基酸。合成蛋白質的20種標準氨基酸中，只有脯氨酸為亞氨基酸，其余都是α-氨基酸。（二）氨基酸的分類非極性中性氨基酸極性中性基氨基酸極性酸性氨基酸極性堿性氨基酸根據R基極性大小分：R基有極性，但不帶電，呈親水性R基無極性，呈疏水性R基有極性，電離后R基帶負電荷R基有極性，電離后R基帶正電荷甘氨酸

glycine

Gly

G

5.97丙氨酸

alanineAlaA

6.00纈氨酸

valineValV

5.96亮氨酸

leucineLeuL

5.98異亮氨酸

isoleucineIleI

6.02苯丙氨酸

phenylalaninePheF

5.48脯氨酸

prolineProP

6.30非極性疏水性氨基酸色氨酸

tryptophanTryW

5.89絲氨酸

serineSerS

5.68酪氨酸

tyrosineTyrY

5.66

半胱氨酸

cysteineCysC

5.07

蛋氨酸

methionine

MetM

5.74天冬酰胺

asparagineAsnN

5.41

谷氨酰胺

glutamineGlnQ

5.65

蘇氨酸

threonineThrT5.602.極性中性氨基酸天冬氨酸

asparticacidAspD

2.97谷氨酸

glutamicacidGluE

3.22賴氨酸

lysineLysK

9.74精氨酸

arginineArgR

10.76組氨酸

histidineHisH

7.593.酸性氨基酸4.堿性氨基酸幾種特殊氨基酸脯氨酸（亞氨基酸）

半胱氨酸

+胱氨酸二硫鍵-HH（二）氨基酸的理化性質1.兩性解離及等電點等電點(isoelectricpoint,pI)

在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點。氨基酸具有氨基、羧基等能接受H+而成——NH3+具堿性能電離出H+而成——COO-具酸性pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸的兼性離子

陽離子陰離子2.紫外吸收色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm

附近。大多數蛋白質含有這兩種氨基酸殘基，所以測定蛋白質溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質含量的快速簡便的方法。3.茚三酮反應氨基酸與茚三酮水合物共熱，可生成藍紫色化合物，其最大吸收峰在570nm處。由于此吸收峰值與氨基酸的含量存在正比關系，因此可作為氨基酸定量分析方法。茚三酮反應

（藍紫色）脯氨酸、羥脯氨酸與茚三酮反應生成黃色化合物二、肽*肽鍵(peptidebond)是由一個氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基脫水縮合而形成的化學鍵。（一）肽(peptide)+-HOH甘氨酰甘氨酸肽鍵肽鍵有部分雙鍵性質肽鍵由于共振而具有部分雙鍵性質，因此，肽鍵比一般C-N鍵短，且不能自由旋轉肽鍵原子及相鄰的a碳原子組成肽平面相鄰的a碳原子呈反式構型肽鍵比一般C-N鍵短肽鍵為一平面相鄰的a碳原子呈反式構型肽鍵平面*肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。*兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽……*肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全，被稱為氨基酸殘基(residue)。*由十個以內氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)。N末端：多肽鏈中有自由氨基的一端C末端：多肽鏈中有自由羧基的一端多肽鏈有兩端*多肽鏈(polypeptidechain)是指許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結構。多肽鏈的結構

側鏈N-末端C-末端主鏈骨架HOHN末端C末端牛核糖核酸酶（二）生物活性肽1.谷胱甘肽(glutathione,GSH)功能基：-SH解毒劑、抗氧化劑GSH過氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH還原酶NADPH+H+NADP+

體內許多激素屬寡肽或多肽神經肽(neuropeptide)2.多肽類激素及神經肽蛋白質的分子結構

TheMolecularStructureofProtein

第二節第二節蛋白質的分子結構蛋白質的分子結構基本結構空間結構一級結構二級結構三級結構四級結構蛋白質的分子結構包括一級結構(primarystructure)二級結構(secondarystructure)三級結構(tertiarystructure)四級結構(quaternarystructure)高級結構定義蛋白質的一級結構是指多肽鏈中氨基酸的排列順序。一、蛋白質的一級結構主要的化學鍵肽鍵，有些蛋白質還包括二硫鍵。

一級結構是蛋白質空間構象和特異生物學功能的基礎。二、蛋白質的二級結構蛋白質分子中某一段肽鏈的局部空間結構，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側鏈的構象

。定義

主要的化學鍵：

氫鍵

（一）肽單元參與肽鍵的6個原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所處的位置為反式(trans)構型，此同一平面上的6個原子構成了所謂的肽單元

(peptideunit)

。在肽平面上，2個C處于反式位置，N-C鍵和C-C鍵可以旋轉，主鏈構象的形成與改變就是通過肽平面圍繞C旋轉來實現的。蛋白質二級結構的主要形式

-螺旋(-helix)

-折疊(-pleatedsheet)

-轉角(-turn)

無規卷曲(randomcoil)

（二）-螺旋鮑林是著名的量子化學家，他在化學的多個領域都有過重大貢獻。曾兩次榮獲諾貝爾獎金（1954年化學獎，發現蛋白質的-螺旋結構，1962年和平獎）。

α-螺旋（α-helix）

右手螺旋

肽平面圍繞C旋轉盤繞形成。

每周含3.6個殘基

螺距0.54nm

作用鍵：氫鍵（由肽鍵的羰基O與向后第五個氨基酸的氨基H形成，非常穩定)。螺旋直徑：0.5nm0.50nm0.54nm氫鍵α-碳原子側鏈（三）-折疊-sheet多肽鏈局部肽段的主鏈呈鋸齒狀伸展狀態2.β-折疊

（β-sheet）鋸齒狀一個折疊2AAR基兩側交錯排列順向平行(0.65nm)、逆向平行(0.7nm)作用鍵：氫鍵(相鄰折疊肽段的連接)穩定平行俯視側視反平行俯視側視（四）-轉角和無規卷曲-轉角無規卷曲是用來闡述沒有確定規律性的那部分肽鏈結構。-轉角常位于肽鏈進行180度回轉是的轉角上4個AA組成氫鍵第一AA羰基O與第四AA氨基H形成第二個AA殘基為脯氨酸，其它殘基常為Gly、Asp、Asn、Trp（五）模體（超二級結構）在許多蛋白質分子中，可發現二個或三個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近，形成一個特殊的空間構象，被稱為模體(motif)。鈣結合蛋白中結合鈣離子的模體鋅指結構與DNA或RNA結合（六）氨基酸殘基的側鏈對二級結構形成的影響蛋白質二級結構是以一級結構為基礎的。一段肽鏈其氨基酸殘基的側鏈適合形成-螺旋或β-折疊，它就會出現相應的二級結構。三、蛋白質的三級結構整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。（一）定義化學鍵氫鍵、疏水鍵、離子鍵、二硫鍵等次級鍵親水基團：分子表面；疏水基團：分子內部較遠氨基酸的相互作用一級結構彼此遠離二級結構不同多肽鏈的進一步折疊相互靠近相互作用，形成穩定的空間結構是一條肽鏈構成的蛋白質具有生物活性的基礎三級結構示意圖二硫鍵極性基團離子鍵肌紅蛋白(Mb)的三級結構

N端C端纖連蛋白分子的結構域（二）結構域大分子蛋白質的三級結構常可分割成一個或數個球狀或纖維狀的區域，折疊得較為緊密，各行使其功能，稱為結構域(domain)。免疫球蛋白結構域

重鏈輕鏈結構域（三）分子伴侶分子伴侶(chaperon)通過提供一個保護環境從而加速蛋白質折疊成天然構象或形成四級結構。*分子伴侶可逆地與未折疊肽段的疏水部分結合隨后松開，如此重復進行可防止錯誤的聚集發生，使肽鏈正確折疊。*分子伴侶也可與錯誤聚集的肽段結合，使之解聚后，再誘導其正確折疊。*分子伴侶在蛋白質分子折疊過程中二硫鍵的正確形成起了重要的作用。亞基之間的結合力主要是疏水作用，其次是氫鍵和離子鍵。四、蛋白質的四級結構蛋白質分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質的四級結構。有些蛋白質分子含有二條或多條多肽鏈，每一條多肽鏈都有完整的三級結構，稱為蛋白質的亞基

(subunit)。血紅蛋白的四級結構

從一級結構到四級結構血紅蛋白蛋白質的一級結構是它的氨基酸序列蛋白質的二級結構是由氫鍵導致的肽鏈卷曲與折疊Primary

structureSecondary

structure蛋白質的三級結構是多肽鏈自然形成的三維結構蛋白質的四級結構是亞基的空間排列Polypeptide

(singlesubunit

oftransthyretin)Transthyretin,withfour

identicalpolypeptidesubunitsTertiary

structureQuaternary

structure五、維持蛋白質分子空間構象的主要化學鍵

氫鍵、疏水鍵、離子鍵、范德華力、二硫鍵等離子鍵疏水鍵二硫鍵氫鍵范德華力蛋白質結構與功能的關系TheRelationofStructureandFunctionofProtein第三節蛋白質的一級結構決定其高級結構蛋白質的空間構象決定蛋白質的生物學功能（一）一級結構是空間構象的基礎一、蛋白質一級結構與功能的關系牛核糖核酸酶的一級結構二硫鍵天然狀態，有催化活性尿素、β-巰基乙醇去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態，無活性某些蛋白質的一級結構加工后，才具有生物學活性。如胰島素原（proinsulin）的一級結構加工一級結構的改變可引起某些疾病的發生由于基因突變導致蛋白質分子的變異或缺失而產生的疾病，稱為分子病（moleculardisease）。如鐮狀紅細胞性貧血（二）一級結構與功能的關系例：鐮刀形紅細胞貧血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽鏈HbAβ肽鏈N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)（三）同源蛋白質存在序列同源現象不同種屬來源的一些蛋白質的氨基酸序列非常相似，構象相似，功能也一致，這些Pro稱為同源蛋白質。同源Pro氨基酸序列的這種相似性稱為序列同源性。在同源Pro的氨基酸序列中，許多位置的AA是相同的，這些AA稱為不變殘基（維持構象和生物活性）。而其它位置差異較大的AA，稱為可變殘基（免疫學性質有關）。（一）肌紅蛋白與血紅蛋白的結構二、蛋白質空間結構與功能的關系目錄Hb與Mb一樣能可逆地與O2結合，Hb與O2結合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分數（稱百分飽和度）隨O2濃度變化而改變。（二）血紅蛋白的構象變化與結合氧肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線任何一個亞基接受氧分子后，會增進其它亞基吸附氧分子的能力環境氧濃度高時Hb快速吸收氧分子環境氧濃度低時Hb快速釋出氧分子動脈靜脈血紅蛋白對氧的運輸*協同效應(cooperativity)一個寡聚體蛋白質的一個亞基與其配體結合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結合能力的現象，稱為協同效應。如果是促進作用則稱為正協同效應(positivecooperativity)如果是抑制作用則稱為負協同效應

(negativecooperativity)血紅蛋白結合氧前后構象的變化Hb(T態)HbO2(R態)α1β1α2β215oO2血紅素與氧結合后，鐵原子半徑變小，就能進入卟啉環的小孔中，繼而引起肽鏈位置的變動。變構效應(allostericeffect)蛋白質空間結構的改變伴隨其功能的變化，稱為變構效應。（三）蛋白質構象改變與疾病蛋白質構象疾病：若蛋白質的折疊發生錯誤，盡管其一級結構不變，但蛋白質的構象發生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發生。蛋白質構象改變導致疾病的機理：有些蛋白質錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產生毒性而致病，表現為蛋白質淀粉樣纖維沉淀的病理改變。這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。瘋牛病中的蛋白質構象改變瘋牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一組人和動物神經退行性病變。正常的PrP富含α-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質的作用下可轉變成全為β-折疊的PrPsc，從而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折疊正常瘋牛病第四節蛋白質的理化性質與分離純化ThePhysicalandChemicalCharactersandSeparationandPurificationofProtein（一）蛋白質的紫外吸收由于蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質的OD280與其濃度呈正比關系，因此可作蛋白質定量測定。一、一般性質蛋白質（色氨酸、酪氨酸）（苯丙氨酸）

λ=280nm

紫外吸收（與蛋白質濃度成正比）λ=260nm10,000100010010200250300波長（nm）TrpPheTyr摩爾吸光度（M-1cm-1）（二）蛋白質的兩性電離蛋白質分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。*蛋白質的等電點(isoelectricpoint,pI)當蛋白質溶液處于某一pH時，蛋白質解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質的等電點。蛋白質的兩性電離和等電點與氨基酸的兩性電離、等電點相同（三）蛋白質的呈色反應⒈茚三酮反應(ninhydrinreaction)

蛋白質經水解后產生的氨基酸也可發生茚三酮反應。2.酚試劑反應：磷鎢酸蛋白質藍藍色化合物色化合

藍色化合物3.米倫試劑反應：米倫試劑蛋白質紅色沉淀△磷鉬酸4.雙縮脲反應(biuretreaction)蛋白質和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現紫色或紅色，此反應稱為雙縮脲反應，雙縮脲反應可用來檢測蛋白質水解程度。雙縮脲反應：Cu2+蛋白質紫色絡合物OH-（一）蛋白質的膠體性質蛋白質屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達1～100nm，為膠粒范圍之內。蛋白質溶液是穩定親水膠體溶液*蛋白質膠體穩定的因素顆粒表面同種電荷水化膜二、大分子特性蛋白質不能通過生物膜(半透膜)維持血漿和組織間液之間的膠體滲透壓。可用透析(dialysis)的方法使蛋白質純化透析：將有小分子雜質的蛋白質溶液封入半透膜制成的透析袋中，侵入流動水或緩沖液中，小分子物質從袋內析出而使蛋白質純化的過程。

+++++++帶正電荷的蛋白質－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質在等電點的蛋白質水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質不穩定的蛋白質顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質的聚沉（二）蛋白質的擴散與沉降蛋白質分子大，擴散速度慢沉降：通過超速離心克服布朗運動使蛋白質顆粒下沉的現象沉降系數（S）可粗略反映蛋白質分子大小（三）蛋白質的變性、沉淀和凝固*蛋白質的變性(denaturation)在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構象被破壞，也即有序的空間結構變成無序的空間結構，從而導致其理化性質改變和生物活性喪失。3.蛋白質的變性與復性

變性劑蛋白質空間構象破壞生物學活性喪失理化性質改變加熱、酸堿、有機溶劑、尿素、鹽酸胍、去污劑易水解易沉淀蛋白質非共價鍵和二硫鍵破壞，不涉及肽鍵造成變性的因素如加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等。

變性的本質——破壞非共價鍵和二硫鍵，不改變蛋白質的一級結構。應用舉例臨床醫學上，變性因素常被應用來消毒及滅菌。此外,防止蛋白質變性也是有效保存蛋白質制劑（如疫苗等）的必要條件。

若蛋白質變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質仍可恢復或部分恢復其原有的構象和功能，稱為復性(renaturation)。天然狀態，有催化活性尿素、β-巰基乙醇去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態，無活性*蛋白質沉淀在一定條件下，蛋白疏水側鏈暴露在外，肽鏈融會相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變性的蛋白質易于沉淀，有時蛋白質發生沉淀，但并不變性。*蛋白質的凝固作用(proteincoagulation)蛋白質變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。

三、蛋白質的分離純化鑒定技術蛋白質在細胞內常與核酸、多糖、脂類及其它小分子物質結合在一起，需要對其進行分離、純化與鑒定。（一）離心原理：分子大小、密度不同→沉降速度不同分類：普通離心：3~10kr/min高速離心：10~25kr/min超速離心：＞25kr/min常用S值表示蛋白質分子質量相對大小（二）透析(dialysis)用透析袋（半透膜）把大分子和小分子分開的方法（三）沉淀