第六章種子擴培

第六章種子擴大培養

一、種子擴大培養的任務和目的

1、種子擴大培養的任務，不但要得到純而壯的培養物，還要獲得活力旺盛的、性能穩定、接種數量足夠的、純的培養物。2、種子擴大培養是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態的生產菌種接入試管斜面活化后，再經扁平或搖瓶及種子罐逐級擴大培養而獲得一定數量和質量的純種過程。

3、菌種擴大培養的目的

為發酵罐的投料提供足夠數量的代謝旺盛的種子。因為發酵時間的長短和接種量的大小有關，接種量大，發酵時間則短。將較多數量的成熟菌體接入發酵罐中，就有利于縮短發酵時間，提高發酵罐的利用率，并且也有利于減少染菌的機會。

對于不同產品的發酵過程來說，必須根據菌種生長繁殖速度快慢及生產的規模決定種子擴大培養的級數。4、種子標準菌種細胞生長活力強，遲緩期短生理性狀穩定能滿足大發酵罐要求無雜菌污染保證穩定的生產能力。種子擴大流程圖

二、種子擴大培養(制備)階段實驗室種子的制備：生產車間種子制備:

A

實驗室種子的制備：

e.g產黃青霉菌(P.chrysogonum)原始菌種斜面試管獲得孢子250ml茄子瓶（大米或小米）25~28℃，4~14天成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于4℃冰箱保存）。

對于不產孢子的赤霉素生產菌，也可用大米固體培養基在茄子瓶中培養菌絲體，用作種子罐種子。產孢子能力不強或孢子發芽慢的菌種，如產鏈霉素的灰色鏈霉菌，產卡那霉素的卡那鏈霉菌，可以用搖瓶液體培養法，孢子接入含液體培養基的搖瓶中，于搖床上培養，獲得菌絲體，作為種子。不產孢子的細菌，如生產谷氨酸的棒狀桿菌、短桿菌，生產上一般采用斜面營養細胞進行擴培，再轉入液體搖瓶培養，獲得細胞懸液再接種。e.g.Glutamicacid-producer：（谷氨酸生產菌）原始菌種（出發菌種）固體試管斜面（32°C，18~24小時）

三角瓶培養（搖床）

種子罐培養e.g.yeast：原始菌種（出發菌種）10ml麥汁試管250ml三角瓶培養（27°C~28°C，3天）（25°C，2天）5~10L卡氏罐（15°C~20°C，3~5天）B：生產車間種子制備：

種子罐的作用：使有限數量的孢子(菌體)發芽、生長、并繁殖成大量的菌絲體(菌體)，滿足發酵罐的需要（菌體生長和產物形成）。實驗室種子進入種子罐有孢子進罐法和搖瓶菌種進罐法。

種子罐級數的確定：種子罐級數是指制備種子逐級擴培的次數。依據：菌種生長特性，孢子發芽及菌體繁殖的速度以及所用的發酵罐的容積。種子罐(seedingtank)的級數產物的品種生產規模工藝條件

種子罐級數越少越好，原因：

簡化生產工藝和控制減少接種帶來的染菌機會需考慮：盡量延長發酵罐生產產物的時間，縮短由于種子發芽、生產而占用的非生產時間，以提高發酵罐的生產率［產物／ml·h］。e.g.Glutamatefermentation一級種子擴培實驗室種子種子罐發酵罐e.g.penicillinfermentation二級種子擴培實驗室種子一級種子罐二級種子罐發酵罐e.g.Streptomycinfermentation三級種子擴培實驗室種子一級種子罐二級種子罐三級種子罐發酵罐

(Streptomycesgriseus)－－灰色鏈霉菌

種齡與接種量：

種齡(seedage)指種子罐培養種子從開始至結束的培養時間。

過老：生產能力下降，菌體自溶。

過嫩：前期生長緩慢，發酵周期延長，產物形成時間推遲，甚至造成異常發酵。

適宜時間：以菌體處于生命力極為旺盛的對數生長期，且培養液中菌體量還未達到最高峰時，較為適宜。嗜堿性芽孢桿菌生產堿性蛋白酶，培養12小時接種，酶活最高。

接種量:指移入的種子的體積和接種后培養液的體積比。

接種量的大小決定于生產菌種在發酵罐中的繁殖速度。

種子多，種子液中含有大量的胞外水解酶，有利于對基質的利用。生產菌迅速占據了整個培養環境，減少染菌機會。但種子過多，易使菌體（菌絲體）生長過快，培養液粘度增加，溶氧降低，產物合成受影響。

e.g.嗜堿性芽孢桿菌生產堿性蛋白酶接種1%，酶活最高；1.5%~4%影響不大；大于4%，酶產量明顯下降。

制霉菌素生產中，1%比10%效果好，0.1%與1%效果相當。

發酵生產的趨勢：采取大接種量及豐富培養基。如谷氨酸：大接種量20%。有的采用雙種法增大接種量：兩只種子罐一只發酵罐如卡那霉素：雙種比單種的發酵單位提高8%，到達產量高峰的時間提前。

倒種法：將培養適宜的發酵液倒出適量給另一個發酵罐作為種子。如鏈霉素：倒種法比單種法的發酵單位提高12%。

三、影響種子質量的因素

1、原材料質量：如四環素、土霉素生產中配制孢子培養基的麩皮、霉菌用的大（小）米、瓊脂的牌號的不同、蛋白胨加工原料不同等均影響種子的質量。原料質量的波動，起主要作用的是其中的無機鹽含量的不同，如微量元素Mg++、Ca++、Ba++能刺激孢子的形成。P含量的多少也影響種子的質量。氨基酸發酵中，淀粉水解糖制備后，加入其他的營養物（麩皮水解液、豆餅水解液、玉米漿），也對種子質量多少有些影響。一般情況：培養基糖分要少，氮源要多，無機鹽所占的比例要大。種子罐和發酵罐培養基成分趨于一致也有好處，種子很快適應，但各成分的數量根據目的各自確定。

總之，各成分選擇得當，才能發揮菌種的特征，提高產量。

2、培養條件：

溫度、pH值、濕度、培養時間和冷藏時間等都影響種子質量。溫度：影響孢子質量濕度：對孢子的數量和質量影響很大。

如土霉素生產菌種龜裂霉菌的孢子，在北方干燥地區孢子斜面長的快，在含少量水分的試管斜面培養基中下部孢子長的好，而上部孢子稀少；氣溫高，濕度大的地區，斜面孢子長的慢，試管下部冷凝水多而不利于孢子形成。

一般相對濕度40~45%時孢子數量最多，孢子顏色均勻，質量較好。通氣量：提高種子質量，如青霉素發酵，一級種子通氣1：3，二級種子1：1.1-1.5，否則菌絲結團，影響種子質量。冷藏時間：如土霉素菌種孢子斜面培養四天左右，即于4℃冰箱保存，發現冷藏7~8天菌體自溶，而培養五天以后冷藏，20天未發現自溶。鏈霉素生產菌，斜面孢子在6℃冷藏兩個月后的發酵單位比冷藏一個月降低8%。

四、種子質量的控制措施

必須保證生產菌種的穩定性；提供種子培養的適宜環境條件，保證無雜菌侵入。

1、菌種穩定性的檢查：少量菌種--無菌生理鹽水--遞增稀釋--平板劃線培養。挑出形態整齊，孢子豐滿的菌落進行搖瓶試驗，測定其生產能力。

2、無菌檢查：顯微鏡觀察、種子液進行無菌檢驗、生化分析。種子液平板劃線、斜面培養用肉眼觀察是否有異常菌落、異常現象及鏡檢是否有雜菌。五、種子質量的判斷：考察種子在發酵罐中所表現出來的生產能力。感官判斷：看顏色、聞氣味理化指標測定：1、pH值2、培養基滅菌后的糖、氨基氮3、菌體形態、濃度4、產物量5、殘糖濃度6、酶活力（如土霉素生產，淀粉酶的活力與發酵單位有一定的關系）。六、工業微生物培養的類型

靜置培養法：即將培養基盛于發酵容器中，在接種后，不通空氣進行培養發酵，也稱為嫌氣性培養。

通氣培養法：生產菌種以需氧菌和兼性需氧菌居多，它們生長的環境必須供給空氣，以維持一定的溶解氧水平，使菌體迅速生長和發酵，也稱為好氣性培養。

1、表面培養法（surfaceculturing)：

好氧靜置培養法。針對容器內培養基物形態又分為液態表面培養和固體表面培養。這種方法菌的生長速度與培養基的深度有關，單位體積的表面積越大，生長速度越快。

2、固體培養（發酵）法(solidculturing)：

固體培養又分為淺盤(shallowpan)固體培養和深層固體培養，統稱曲法培養。它起源于我國釀造生產特有的傳統制曲技術。其最大特點是固體曲的酶活力高。

3、液體深層培養（發酵）法：(liquidsubmerged

culturing)

液體深層發酵法從罐底部通氣，進入的空氣由攪拌槳葉分散成微小氣泡以促進氧的溶解。這種由罐的底部通氣攪拌的培養方法，相對于由氣液界面靠自然擴散使氧溶解的表面培養法來講，稱為深層培養法。液體曲(liquidkoji)、檸檬酸、谷氨酸、肌苷酸(inosinicacid)及其他發酵產品先后采用此法進行生產。

特點：容易按照生產菌種對于代謝的營養要求以及不同生理時期的通氣、攪拌、溫度、培養基中氫離子濃度等條件，選擇最佳培養條件。外循環帶升式發酵罐

內循環帶升式發酵罐

小型機械攪拌發酵罐1—三角皮帶轉軸；2—軸承支架；3—聯軸節；4—軸封；5—窺鏡；6—取樣口；7—冷卻水出口；8—夾套；9—螺旋片；10—溫度計接口；11—軸；12—攪拌器；13—底軸承；14—放料口；15—冷水進口；16—通風管；17—熱電偶接口；18—擋板；19—接壓力表；20—手孔；21—電動機；22—排氣口；23—取樣口；24—進料口；25—壓力表接口；26—窺鏡；