實驗1大腸桿菌的分離和培養

選考第33題內容：選修1生物技術實踐、選修3現代生物科技專題形式：一般10個填空（1分/空）

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2個（單項）選擇（2分/題）生物選考試題分布：選擇題：25+3（50+6=56分）非選擇題：3+2（6+7+7+14+10=44分）選修1生物技術實踐第一部分微生物的利用實驗1大腸桿菌的培養和分離實驗2分離以尿素為氮源的微生物第二部分酶的應用實驗4果汁中的果膠和果膠酶實驗6

α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測第三部分生物技術在食品加工中的應用實驗8果酒及果醋的制作實驗10泡菜的腌制和亞硝酸鹽的測定第四部分淺嘗現代生物技術實驗11植物的組織培養第一部分微生物的利用微生物：是指結構簡單、形體微小的單細胞、多細胞或沒有細胞結構的低等生物，如酵母菌、細菌、放線菌、霉菌、藍細菌和病毒等。絕大多數微生物與傳染病無關，90%以上的微生物是對人類有益的。微生物有多種用途，許多抗生素來源于放線菌和霉菌；有些食品由微生物發酵制成，如酒由酵母發酵產生，腐乳由紅曲霉和毛霉發酵制成。實驗1大腸桿菌的培養和分離基本要求1.進行大腸桿菌的擴增，利用液體培養基進行細菌培養的操作。2.進行大腸桿菌的分離，用固體平面培養基進行細菌的培養。一、大腸桿菌

革蘭氏陰性、兼性厭氧的腸道桿菌在腸道中一般對人無害但也有一些菌株對人體是有害的，可侵襲腸粘膜并產生毒素任何大腸桿菌如果進入人的泌尿系統，都會對人體產生危害。結晶紫碘液95%乙醇革蘭氏染色法1min革蘭陽性

革蘭陰性1min脫色蕃紅復染菌落（colony）：一個細菌細胞在固體培養基上發展成一個肉眼可見，具一定形態結構的子細胞群。光滑型菌落粗糙型菌落二、細菌的培養和分離1、實驗儀器設備：移液槍接種環玻璃刮刀超凈工作臺（保證無菌環境）高壓蒸汽滅菌鍋恒溫培養箱搖床2、培養基：平板斜面固體培養基LB培養基：蛋白胨：0.5g酵母提取物：0.25gNaCl:0.5gH2O:50mL瓊脂：1g液體培養基固體培養基調pH值菌膜菌沉淀均勻渾濁對照液體培養基（培養液）3、實驗步驟：（1）培養基、培養皿滅菌

——高壓蒸汽滅菌法

將配制好的50mlLB液體和固體培養基分別裝入250ml三角瓶中，加上封口膜；

將培養皿用牛皮紙包好；置于滅菌鍋內1kg壓力滅菌15min

（121℃）無菌技術

最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，同時可以基本保持培養基的營養成分不被破壞。有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞（不能用脫脂棉：易吸水引起后引起污染），也可采用各種金屬、塑料、封口膜及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。（160℃2h或170℃1h）高壓蒸汽滅菌法：玻璃器皿、金屬、移液槍頭等（火焰）灼燒：接種環、試管口、三角燒瓶口紫外燈+過濾風：超凈臺滅菌消毒：如75%酒精棉球（消毒：利用化學或物理方法，殺死大部分致病微生物的過程。）（2）倒平板

滅菌后，待滅菌鍋壓力與大氣壓力相同時打開鍋蓋將有培養基的三角瓶和培養皿放到超凈臺上打開超凈臺的紫外燈和過濾風，待固體培養基冷卻到60℃時，關閉紫外燈用酒精棉球消毒桌面和手。倒平板：10-12ml培養基/培養皿

每倒入一個后立即置于水平位置上，輕輕晃動，使培養基鋪滿平皿底部，待凝，并形成平面。酒精燈旁：左手？右手？制作試管斜面：

將配制好的呈熔化狀態的培養基轉移到試管中時必須用三角漏斗

滅菌試管冷卻到50℃左右，把試管棉塞一端擱在玻棒上，待冷凝后即成試管斜面

將分裝好的含培養基的試管滅菌P21小字部分1/3在試管外，2/3在試管內正確不正確棉塞制作（3）接種培養

左手：將大腸桿菌斜面和有液體培養基的三角燒瓶，靠近酒精燈火焰；

右手：拿接種環，并用無名指和小指夾住斜面的棉塞和三角瓶的封口膜；

接種環在火焰上燒紅，再深入到斜面，使環接觸培養基，再取菌體；

將菌體放入三角瓶的液體培養基中，瓶口封口膜和管口棉塞復原；

將三角瓶置于37℃搖床振蕩培養12h。（4）劃線分離

在酒精燈火焰上灼燒接種環；

將搖床上培養了12h的菌液打開，接種環部分深入到菌液中；

在固體培養基的平板上連續劃線，接種環只在菌液中蘸菌液一次，劃線后蓋好培養皿；

將培養皿倒置（蓋在下面），放到恒溫培養箱中培養12-24h后，可看到在劃線的末端出現不連續的單個菌落，表明菌已被分離。劃線分離法劃線的起點要有菌，且每一次新的起點應比前一次的起點菌含量（濃度）低劃線的最終點不能與前面的劃線點重疊除第1次外，其余幾次劃線前，都要將接種環火焰灼燒恒溫培養箱平板倒置防