感受態(tài)細胞的制備

實驗三大腸桿菌感受態(tài)的制備（CaCl2法）1.實驗目的2.實驗原理3.實驗儀器、材料與試劑4.實驗步驟

5.實驗結果與討論

實驗目的

學習CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞。實驗原理

受體細胞經過一些特殊方法(如電擊法、CaCl2等化學試劑法)的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞(Compenentcells)。進入受體細胞的DNA分子通過復制，表達實現遺傳信息的轉移，使受體細胞出現新的遺傳性狀。將經過轉化后的細胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉化子（Transformant，即帶有異源DNA分子的受體細胞）。實驗儀器、材料與試劑1．超凈工作臺2．低溫離心機3．恒溫搖床4．恒溫培養(yǎng)箱5．-70℃冰箱6．制冰機7．移液器50ul、200ul、1000ul（二）材料大腸桿菌DH5α（Top10）。（三）試劑

1.LB液體培養(yǎng)基2.0.1mol/LCaCl2溶液實驗步驟

1.挑取大腸桿菌DH5α（Top10）的單菌落，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12hr。2.取2mL菌液加入100mlLB液體培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)約2-3h；測OD600值，當OD600約0.4-0.5時，停止培養(yǎng)。3.無菌條件下取1.5ml菌液冰上放置10min，4℃，3,500rpm，離心10min。4.棄上清，在冰浴上加入250ul預冷的無菌CaCl2(0.1mol/L)，輕搖使細胞懸浮。冰上放置10min。5.4℃，3,500rpm離心10min。6.棄上清，用150ul預冷的無菌CaCl2(0.1mol/L)重新懸浮細胞，保存?zhèn)溆?。（加?5%的甘油，-70℃保存，可保存一年）。注意事項1．細菌的生長狀態(tài)：實驗中應密切注視細菌的生長狀態(tài)和密度，盡量使用對數生長期的細胞（一般通過檢測OD600來控制。DH5菌株OD600為0.5時細胞密度是5×107/ml）；2．所有操作均應在無菌條件和冰上進行；3．經CaCl2處理的細胞，在低溫條件下，一定的時間內轉化率隨時間的推移而增加，24小時達到最高，之后轉化率再下降（這是由于總的活菌數隨時間延長而減少造成的）；4．化合物及無機離子的影響：在Ca2+的基礎上聯(lián)合其他二價金屬離子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或還原劑等物質處理細菌，可使轉化效率大大提高（100-1000倍）；5．所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學物質的存在可能大大降低細菌的轉化效率；6．質粒的大小及構型的影響：用于轉化的應主要是超螺旋的DNA；7．一定范圍內，轉化效率與外源DNA的濃度呈正比；實驗注意事項細胞生長狀態(tài)和密度：不要用經過多次轉接或儲于４℃的培養(yǎng)菌，最好從-80℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數生長期時為宜，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600

來控制。DH5α菌株的OD600為0.5時，細胞密度在5×107

個/mL左右，這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉化效率。實驗操作時要格外小心，懸浮細胞時要輕柔，以免造成菌體破裂，影響轉化。1.在制備感受態(tài)細胞的實驗中要注意哪些

細節(jié)？2.影響感受態(tài)細胞轉化效率的因素有哪些？思考題實驗結果與討論