熒光(熒光顯微鏡和熒光分光光度計)

熒光技術韓東洺

細胞生物學科

2014-11-52015年6月15日1熒光和熒光素

利用較短波長的光(激發光)照射樣品，使樣品受到高能量激發，產生較長波長的熒光(發射光)，用來觀察和分辨樣品中產生熒光的物質的成分和位置。2常見熒光素：

（1）異硫氰酸熒光素(fluorescein

isothiocyanate,

FITC)（2）四乙基羅丹明

(rhodamine,

RB200)（3）四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethyl

rhodamine

isothiocynate,

TRITC)（4）鑭系

（5）藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）（6）多甲藻葉綠素蛋白

（peridinin

chlorophyll

protein，PerCP）（7）碘化丙啶（

propidium

iodide，PI）3合適熒光素的選擇：

具有與蛋白質形成共價鍵的化學基團。

熒光效率高，標記后下降不明顯。

熒光色澤與背景色澤對比鮮明。

標記后能保持生物學活性和免疫活性。標記方法簡單、快速。

安全無毒4熒光顯微鏡（fluorescencemicroscope）

熒光顯微鏡的基本構造是由普通光學顯微鏡加上一些附件(如熒光光源、激發濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎上組成的。光源濾光片光路聚光器鏡頭圖像采集系統

熒光光源：高壓汞燈、氙燈或鹵素燈

濾色系統：激發濾色片：置于光源與物鏡之間，用于選擇激發光范圍，只有能激發熒光染料發光的特定波長的光通過。阻擋濾色片：物鏡和目鏡之間，選擇性通過特異的熒光，呈現專一的熒光色彩。

透射光：照明光線從標本下經聚光器透過標本進入物鏡。落射光：照明光線從標本上經垂直照明器落射到標本，經標本反射進入物鏡。

透射熒光顯微鏡光路(a)落射熒光顯微鏡光路(b)光路5熒光顯微鏡標本制作要求（一）載玻片

載玻片厚度應在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發光在標本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發熒光。有時需用石英玻璃載玻片。

（二）蓋玻片

蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對不同波長的光起不同干涉作用的物質（如氟化鎂）的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發光，這種反射的激發光女可激發標本。

（三）標本

組織切片或其他標本不能太厚，如太厚激發光大部分消耗在標本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發。另外，細胞重迭或雜質掩蓋，影響判斷。（四）封裱劑

封裱劑常用甘油，必須無自發熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l

pH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。

（五）鏡油

一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標本時，必須使用鏡油，最好使用特制的無熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對圖像質量略有影響。6使用熒光顯微鏡的注意事項

（1）嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序。

（2）應在暗室中進行檢查。進入暗室后，接上電源，點燃超高壓汞燈5～15min，待光源發出強光穩定后，眼睛完全適應暗室，再開始觀察標本。

（3）防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡。

（4）檢查時間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射3～5min后，熒光也明顯減弱；所以，最多不得超過2～3h。

（5）熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節

省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再用時，須待燈泡充分冷卻后才能點燃。一天中應避免數次點燃光源。（6）標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間防止封裱劑蒸發。

（7）熒光亮度的判斷標準：一般分為四級，即“-”—無或可見微弱熒光。“+”—僅能見明確可見的熒光。“++”—可見有明亮的熒光。“+++”—可見耀眼的熒光。熒光分光光度計工作原理：

由光源氙狐燈發出的光通過切光器使其變成斷續之光以及激發光單色器變成單色光后，此光即為熒光物質的激發光，被測的熒光物質在激發光照射下所發出的熒光，經過單色器變成單色熒光后照射于測樣品用的光電倍增管上，由其所發生的光電流經過放大器放大輸至記錄儀，激發光單色器和熒光單色器的光柵均由電動機帶動的凸輪所控制，當測繪熒光發射光譜時，將激發光單色器的光柵，固定在最適當的激發光波長處，而讓熒光單色器凸輪轉動，將各波長的熒光強度訊號輸出至記錄儀上，所記錄的光譜即發射光譜（emissionspectrum），簡稱熒光光譜。

7熒光分光光度計

當測繪熒光激發光譜時，將熒光單色器的光柵固定在最適當的熒光波長處，只讓激發光單色口的凸輪轉動，將各波長的激發光的強度訊號輸出至記錄儀，所記錄的光譜即激發光譜（emissionspectrum）。

當進行樣品溶液的定量分析時，將激發光單色器固定在所選擇的激發光波長處，將熒光單色器調節至所選擇的熒光波長處，由記錄儀得出的信號是樣品溶液的熒光強度。熒光分光光度計原理圖熒光分光光度計的基本結構是:光源單色器或濾光片樣品池單色器或濾光片檢測器注意事項：

（1）

注意開機順序。

（2）

注意關機順序。

（3）

為延長儀器使用壽命，掃描速度、負高

壓、狹縫的設置一般不宜選在高檔。

（4）

關機后必須半小時（等氙燈溫度降下）

方可重新開機。

8熒光技術的應用（1）免疫熒光技術用熒光標記的抗體或抗原與樣品(細胞、組織或分離的物質等)中相應的抗原或抗體結合，以適當檢測熒光的技術對其進行分析的方法。將抗原或抗體與熒光染料連接，用于檢測相應特異性的抗體或抗原的方法稱“直接免疫熒光技術(directimmunofluorescenttechnique)”。用熒光染料標記的第二、第三抗體等檢測相應抗原抗體復合體的方法則稱“間接免疫熒光技術(indirectimmunofluorescenttechnique)”。抗補體染色法簡稱補體法，是間接染色法的一種改良法，本法利用補體結合反應的原理，用熒光素標記抗補體抗體，鑒定未知抗原或未知抗體(待檢血清)。直接法熒光素標記的特異性抗體直接與相應抗原反應。直接熒光抗體染色法示意圖

間接法特異性抗體與相應抗原反應，熒光素標記的抗抗體再與第一抗體結合。間接熒光抗體染色法示意圖

染色程序分為二步，最終使之形成抗原-抗體-補體-抗補體抗體復合物，發出熒光。抗補體染色法優點缺點直接法特異性高，操作簡便，比較快速。一種標記抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。直接法應設陰、陽性標本對照，抑制試驗對照。間接法既能檢查未知抗原，也能檢查求知抗體;用一種標記的抗球蛋白抗體，能與在種屬上相同的所有動物的抗體結合，檢查各種未知抗原或抗體，敏感性高。

由于參加反應的因素較多，受干擾的可能性也較大，判定結果有時較難，操作繁瑣，對照較多，時間長。間接法應設陰、陽性標本對照，還應設有中間層對照(即中間層加陰性血清代替陽性血清)。補體法即只需要一種標記抗補體抗體，便能檢測各種抗原-抗體系統。參與反應的成分多，染色程序較復雜，比較麻煩。

（2）作為生物大分子篩選與鑒定的標記物

綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein)，簡稱GFP，其基因所產生的蛋白質，在藍色波長范圍的光線激發下，會發出綠色熒光。在生物學研究中綠色熒光蛋白具有廣泛用途，包括有：

分子標記利用綠色熒光的發光機制，可將GFP作為蛋白質標簽(proteintagging)，即利用DNA重組技術，將目的基因與GFP基因構成融合基因，轉染合適的細胞進行表達，然后借助熒光顯微鏡便可對標記的蛋白質進行細胞內活體觀察。

煙草細胞標記的蛋白質進行細胞內的活體觀察

藥物篩選

熒光探針分布是利用信號傳導中信號分子的遷移功能，將一熒光蛋白與信號分子相偶聯，根據熒光蛋白的分布情況即可推斷信號分子的遷移狀況，并推斷該分子在遷移中的功能。由于GFP分子量小，在活細胞內可溶且對細胞毒性較小，因而常用作熒光探針。

（3）熒光原位雜交

原位雜交技術(Insituhybridization，ISH)是用標記的核酸探針，經放射自顯影或非放射檢測體系，在組織，細胞、間期核及染色體上對核酸進行定位和相對定量研究的一種手段。原理：利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細胞或染色體上待測DNA或RNA互補配對，結合成專一的核酸雜交分子，經一定的檢測手段將待測核酸在組織、細胞或染色體上的位置顯示出來。（4）無機分析在無機元素分析中,主要是通過待測元素與有機試劑(或熒光試劑)生成配合物或發生熒光猝滅效應來測定元素的含量。目前

可以通過熒光分析測定70多種金屬離子和陰離子,如Ag、

Al、As、Au、Be、Bi、Ca、Cu、Ge、Ga、Hf、Hg、In、Ir、Li、Mg、Mn、Nb、Ni、Os、Pb、

Pt、Ru、Sb、Sc、Si、Sn、Sr、Ta、Tl、Th、

Ti、V、Y、W、Zn、Ce、Dy、Eu、Gd、La、

Lu、Sm、Cd、Cr(Ⅵ)、Se、Te、Re等（5）有機物分析近年來有機物熒光分析研究在我國發展迅速,年文獻量不斷增加。主要應用領域有中西藥和臨床、食品營養和添加劑等試樣。激光誘導熒光法診斷惡性腫瘤,顯微熒光法研究藥物與細胞的相互作用,DNA編序及含量的熒光法測定均是目前受到關注的熱點問題。環境檢測領域:熒光分光光度計檢測技術已經成為環境污染監測中污染物定性和定量分析的有效手段。如不同類型不同場地的石油及其產品成份各有不同,其熒光光譜也有著顯著的區別,利用油標可在激發310nm,發射365nm處測量淤泥和海水中油污樣品中總油的含量。還可以對機油、柴油、重油、原油及液壓油進行初步鑒定；空氣塵埃中多環芳烴的檢測。其他如陰離子表面活性劑作為洗滌劑污染的主要成份,葉綠素a、葉綠素b、脫鎂葉綠素a和脫鎂葉綠素b作為水環境浮游植物生物量和水體富營養化的重要指標以及多環芳烴等都可用熒光分光光度計測量。食品和藥物成份分析領域：

曾用熒光法分析食品和藥品中的化合物如：維生素A、維生素B1、B2（核黃素）、B6、維生素BC(葉酸或蝶酰谷氨酸)、維生素C、維生素D、維生素E(生育酚)、維生素P(蘆丁)、維生素F（煙酸）、維生素K，抗生素藥中的青梅毒、金霉素、四環素、抗霉素、鏈霉素和放線菌素D等，抗瘧疾藥中的奎寧、瘧滌平、撲瘧母星、嘧啶甲胺和利凡諾等，麻醉藥中的大麻醇、嘜啶鹽酸鹽、四氫大麻醇、嗎啡、可待因、罌粟堿、那可汀、吐根酚堿、依米丁、麻黃素、馬錢子堿鹽酸鹽、毛果（蕓香）鹽酸鹽、弗勒可丁、二丁卡因、麥角酸二乙胺等，鎮痛藥中撲熱息痛、阿司匹林、消炎痛吲哚美辛等等。OLYMPUSBX53OLYMPUSBX53觀察流程熒光分光光度計賽默飛Lumina

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